今天跟大家分享的是2020年4月發表在frontiers in oncology上的一篇文章，影響因子4.137。這是一篇腫瘤微環境：基質+免疫+ESTIMATE評分的文章，之前也分享過類似的文章哦，看來這個思路還是蠻值得借鑒的嘛。BTK Has Potential to Be a Prognostic Factor for Lung Adenocarcinoma and an Indicator for Tumor Microenvironment Remodeling: A Study Based on TCGA Data MiningBTK有可能成為肺腺癌的預后因素和腫瘤微環境重塑的指標：一項基于TCGA數據挖掘的研究腫瘤微環境（TME）在肺腺癌（LUAD）的發生和發展中起著至關重要的作用。然而，在理解TME中免疫和基質成分的動態調節方面仍然存在挑戰。該項研究基于基質評分和免疫評分共同篩選與肺腺癌免疫浸潤的預后因子，并用實驗驗證了其表達。先介紹下文章使用的數據和方法吧。作者從TCGA數據庫下載了551例LUAD病例的轉錄組RNA-seq數據（正常樣品54例;腫瘤樣品497例）和相應的臨床數據。1.2 ImmuneScore，StromalScore和ESTIMATEScore的生成作者使用R語言estimate包中的ESTIMATE算法來估計每個樣本在TME中的免疫基質成分的比率，以三種得分的形式展現：ImmuneScore，StromalScore和 ESTIMATEScore，分別與免疫，基質和兩者之和呈正相關，這意味著相應分數越高，TME中相應成分的比率就越大。使用R包survminer進行生存分析，用Kaplan–Meier方法繪制生存曲線，將對數秩作為統計顯著性檢驗。1.4在ImmuneScore和StromalScore的高分和低分組之間生成DEG作者分別根據與ImmuneScore和StromalScore的中位數，將497個腫瘤樣本分為高分組和低分組。使用R包limma進行差異表達分析。使用clusterProfiler，richplot和ggplot2軟件包，對 379個DEG進行了GO和KEGG富集分析。從TCGA中下載LUAD樣品的臨床病理特征數據。使用R語言進行分析，取決于比較的臨床分期數，使用Wilcoxon秩和或Kruskal–Wallis秩和檢驗作為顯著性檢驗。通過STRING數據庫構建PPI網絡，然后使用Cytoscape進行重構。作者從Molecular Signatures數據庫下載了Hallmark和C7基因集集合，進行GSEA分析。使用CIBERSORT計算方法估算所有腫瘤樣本中的TIC豐度分布，然后進行質量過濾，僅選擇421個p <0.05的腫瘤樣本進行以下分析。
為了建立估計的免疫和基質的比例與存活率的相關性，分別對ImmuneScore，StromalScore和ESTIMATEScore進行Kaplan-Meier生存分析。ImmuneScore 或StromalScore的評分越高，說明TME中的免疫或基質成分越多。ESTIMATEScore是ImmuneScore和StromalScore的總和，表示TME中兩種成分的綜合比例。如圖2A所示，免疫成分的比例與總生存率呈正相關。盡管StromalScore與總生存率無顯著相關性（圖2B），但ESTIMATEScore仍與生存率呈正相關（圖2C）。這些結果表明，TME中的免疫成分更適合于指示LUAD患者的預后。
為了確定免疫和基質成分的比例與臨床病理特征之間的關系，作者從TCGA數據庫中分析了LUAD病例的相應臨床信息。結果顯示，ImmuneScore與TMN期的T分類呈負相關（圖3D）；StromalScore僅與TMN期的M分類負相關（圖3H），而ESTIMATEScore隨TMN期的增加顯著下降（圖3F和圖3I）。這些結果表明免疫和基質成分的比率與LUAD的進展有關，例如侵襲和轉移。
圖3. ImmuneScore和StromalScore與臨床病理分期特征的相關性2.4 ImmuneScore和StromalScore共同的DEG主要表現為免疫相關基因的富集為了確定TME中與免疫和基質成分有關的基因表達譜的確切變化，對高分和低分的樣本進行了差異分析。從ImmuneScore（高分與低分樣本）中獲得了總共776個DEG，626基因上調，而150個基因下調（圖4A，C，D）。同樣，從StromalScore獲得了783個DEG，由665個上調基因和118個下調基因組成（圖4B–D）。Venn圖顯示，ImmuneScore和StromalScore中共有317個高分共享的上調基因，還有62個低分共享的下調基因。這些DEG（共379個基因）可能是TME狀態的決定因素。接下來的GO富集分析的結果表明，DEG與免疫相關的術語相關（圖4E）。KEGG富集分析還顯示這些基因還富集于趨化因子信號傳導通路，細胞因子-細胞因子受體相互作用和造血細胞譜系（圖4F）。因此，DEG與免疫相關，這意味著免疫因子的參與是LUAD中TME的主要特征。
圖4. DEG的熱圖，維恩圖以及GO和KEGG的富集分析為了進一步探討其潛在機制，作者使用Cytoscape軟件在STRING數據庫的基礎上構建了PPI網絡。379個基因之間的相互作用顯示在圖5A中，條形圖表示了按結點數排名的前30個基因（圖5B）。接下來作者進行了LUAD患者生存率的單變量COX回歸分析（圖5C）。然后，作者對PPI網絡中的關鍵節點與按單變量COX回歸p值排序的前16個因子進行交叉分析，僅CCR2和BTK兩個因子與上述分析重疊（圖5D）。
2.6 LUAD患者BTK表達與TNM分期及生存率的關系在這一部分，作者根據BTK中值表達將所有LUAD樣本分為BTK高表達組和BTK低表達組。生存分析表明，高表達BTK的LUAD患者比低表達BTK的患者具有更長的生存期（圖6C）。接下來作者進行了結合臨床特征的BTK分析，Wilcoxon秩和檢驗表明，腫瘤樣本中BTK的表達明顯低于正常樣本中的表達（圖6A）。并且在同一患者的正常組織與腫瘤組織之間的配對分析中觀察到了相似的結果（圖6B）。這些結果表明，TME中BTK的表達與LUAD患者的預后呈正相關。尤其是，隨著TNM分期的進展，BTK的表達下降（圖6D-G）。
圖6. BTK在樣本中的差異表達及其與LUAD患者的生存和臨床病理分期特征的關系
由于BTK的水平與LUAD患者的生存期和TNM分期呈負相關，作者進行了GSEA分析，結果顯示BTK高表達組的基因主要富集免疫相關活性（圖7A），對于BTK低表達組，主要富集的是代謝通路，包括糖酵解，氧化磷酸化和典型的腫瘤通路（圖7B）。對于MSigDB定義的C7集合，免疫基因集、多個免疫功能基因集在高BTK表達組中富集（圖7C）。但是，在低BTK表達組中，幾乎沒有基因集富集（圖7D）。這些結果表明BTK可能是TME狀態的一個潛在指標。
為了進一步證實BTK表達與免疫微環境的相關性，作者使用CIBERSORT算法分析了腫瘤浸潤免疫亞群的比例，并在LUAD樣本中構建了21種免疫細胞譜（圖8）。
差異和相關性分析的結果表明，總共有8種TIC與BTK的表達相關（圖9）。其中5種TICs與BTK表達呈正相關，三種TICs與BTK表達呈負相關。這些結果進一步支持了BTK的水平影響TME的免疫活性。
好啦，文章的思路跟之前發的文章還是很像的，結果得到了分析上和實驗上的驗證，是一篇典型的干濕結合的研究。今天的分享到這里就結束了，感興趣的小伙伴要好好學習哦~
