我們今天看的這篇文章依舊是ceRNA相關的，作者旨在構建一個lncRNA相關的ceRNA網絡來探索胃癌(GC)發生的分子機制，與之前乳腺癌那篇文章有一些相似，但又有其創新之處。
數據和方法 1). 375例胃癌組織和32例癌旁正常組織的mRNASeq數據以及446個GC組織和45個癌旁組織的miRNAseq與相應的臨床數據數據下載自TCGA( June 13, 2018 ); Ensembl數據庫用來識別注釋RNAs，將沒有注釋信息的刪除。 2). 將胃癌和正常樣本的lncRNA, mRNA和miRNA表達數據分別融合成一個矩陣，刪除無表達或count均值小于1的行；用R包’edgeR’識別差異RNAs( FDR < 0.01&|log2FC|≥2); 然后用R包“ggplot2”和“pheatmap”繪制差異RNAs的火山圖和熱圖。 3). 用R包“clusterProfiler”對差異mRNAs (DEmRNAs)做GO和KEGG功能注釋，將顯著的前5個通路可視化。 4). ceRNA網絡構建流程如圖1所示，然后為了挖掘潛在的ceRNA調控軸，剔除ceRNA網絡中正相關的lncRNA-miRNA對和miRNA-mRNA對,R包“ggalluvial”將其可視化。5). 54組配對的胃癌臨床樣本由北京醫院胃腸外科提供；Human gastric epithelial cell line (GES-1)和GC cell lines (MKN-45 and HGC-27)購買自American Type Culture Collection (ATCC, Manassas)，并將其培養、轉染；然后對這些樣本做qRT-PCR。6). 合成含野生型或突變體miR-372結合位點的CADM2 或ADAMTS9-AS2的3’-UTR序列, 然后用ADAMTS9-AS2/CADM2 3’UTR報告熒光素酶質粒和miR-372 mimics模擬物或miR-NC共轉染MKN-45細胞。轉染48小時后，用雙熒光素酶報告系統檢測熒光素酶活性，將螢火蟲熒光素酶正常化為腎小球熒光素酶。 7). 下載完TCGA的臨床數據后，用R包“survival”做生存分析和統計顯著性分析。
圖1
結果 1). 基于TCGA數據，總共識別出1,022 差異表達的DElncRNAs, 104 DEmiRNAs和1,632 DEmRNAs，三種差異RNAs的火山圖如圖2.a所示; 2). 對1,632 個DEmRNAs的GO和KEGG功能注釋結果如圖2.b-c，大多與癌癥的發生發展相關；3). 構建的ceRNA網絡由41個DElncRNAs, 9個DEmiRNAs和10個DEmRNAs組成，共115條邊(圖3.a)，其中ADAMTS9-AS2(lncRNA)起著重要作用(圖3.b)；然后作者挑選出負調控關系對構建調控軸，包含18個lncRNAs, 4個 miRNAs和6個mRNAs(圖3.c)。 4). 對DERNAs的生存分析，識別出7個lncRNAs( ADAMTS9-AS2, ARHGEF26-AS1, HOTAIR, HOTTIP, LINC00052, NKX2-1-AS1, and VCAN-AS1 )和5個mRNAs ( CADM2, COL1A1, FAM129A,
SERPINE1, and TMEM100 )與生存期顯著相關；對ceRNA網中lncRNAs和mRNAs的相關性分析表明，ADAMTS9-AS2的表達與CADM2, TMEM100和 FAM129A顯著相關； 5). ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2作為潛在調控軸被挖掘出來，ADAMTS9-AS2和CADM2在胃癌樣本中都顯著下調，而且它們的低表達與低生存率有關； 6).實驗驗證: 在54組配對的臨床樣本中，有44組的ADAMTS9-AS2在胃癌樣本中是下調的；并且在MKN-45和HGC-27兩個細胞系中也是低表達的(前者相對較高)，miR-372在敲除ADAMTS9-AS2的MKN-45細胞中表達顯著增加，而在ADAMTS9-AS2過量表達的HGC-27細胞中則降低，基因CADM2的表達水平與之相反；而且miRcode和TargetScan中在ADAMTS9-AS2和CADM2的3’UTR區域預測到了miR-372的結合位點；雙熒光素酶報告試驗顯示，miR-372模擬物顯著抑制ADAMTS9-AS2-Wt的相對熒光素酶活性，而ADAMTS9-AS2-Mut未受影響，同時，野生型CADM2的3’UTR質粒的熒光素酶活性在miR-372模擬反應下顯著降低，但突變的CADM2 3’ UTR熒光素酶活性也未受影響，表明這一調控軸關系確是存在的。
圖2
圖3
總的來說就是作者基于TCGA數據，識別出了胃癌相關的差異RNAs,然后構建了lncRNA-miRNA-mRNA網絡，并重點挖掘出調控關系ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2，然后用多套新的數據集加以驗證，證實了其可靠性。
最后，送給大家一句話: Nothing is impossible to a willing heart.
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