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近日，Nature子刊npj Precision Oncology（IF：10.092）發(fā)表了一篇文章，作者使用了三種EML4-ALK肺癌小鼠模型來測試宿主免疫在阿來替尼治療反應中的作用。μCT連續(xù)測定腫瘤體積，流式細胞術和多譜免疫熒光法測定免疫細胞含量。通過RNA-seq評估對阿來替尼的轉(zhuǎn)錄反應，并通過ELISA檢測分泌趨化因子。實驗結(jié)果支持適應性免疫在TKI反應持久性中的作用，并證明腫瘤微環(huán)境的免疫細胞組成可預測對阿來替尼治療的反應。
含有致癌EML4-ALK融合的肺癌對靶向酪氨酸激酶抑制劑(TKIs;例如，阿萊克替尼)，收縮程度和治療時間(DOT)有所不同。然而，控制這種反應的因素還沒有得到很好的理解。雖然免疫系統(tǒng)在介導免疫治療反應中的作用已被廣泛研究，但關于免疫對TKI治療反應的作用尚不清楚。之前已經(jīng)證明了TKI誘導的IFNγ轉(zhuǎn)錄反應與EGFR突變肺癌中的DOT呈正相關。事實上，越來越多的文獻支持宿主免疫細胞在精確腫瘤藥物和細胞毒性藥物的整體治療反應中的作用。然而，TKIs誘導因子介導旁分泌信號傳遞到免疫微環(huán)境的機制以及對整體治療反應的貢獻尚不清楚。臨床前小鼠模型概括了人類疾病的關鍵特征，為深入的機制探索開辟了道路。
注入Adeno-Cas9-gRNA病毒在C57BL/6小鼠中誘導了多個腫瘤病灶。絕大多數(shù)病灶在阿來替尼治療后迅速而顯著地縮小。此外，TKI治療4周后終止治療導致部分(但不是全部)病變在4周內(nèi)迅速再生，這表明存在殘留疾病。因此，EML4-ALK驅(qū)動的肺癌小鼠模型和人類疾病一樣表現(xiàn)力對治療反應的異質(zhì)性。為了進一步研究介導反應深度和持續(xù)時間變化的分子機制，開發(fā)了一組來自該模型的可移植小鼠EML4-ALK癌細胞系。
小鼠ALK+細胞系被稱為EA2，還開發(fā)了另外兩種EML4-ALK驅(qū)動的細胞系，EA1和EA3。從C57BL/6小鼠中分離出所有細胞系。EA2和EA3細胞系來源于TP53缺失小鼠，而EA1細胞系來源于TP53野生型小鼠。這三種細胞系對ALK TKIs、阿來替尼和lorlatinib表現(xiàn)出體外生長敏感性(圖1a)。阿來替尼可等效地降低MAPK通路調(diào)控基因ETV4、ETV5、FOSL1和DUSP6的mRNA水平（圖1b）。這表明EA1，EA2和EA3細胞在體外功能試驗中對阿來替尼的敏感性相同。
用三株EML4-ALK細胞系在同基因C57BL/6小鼠左肺葉建立原位腫瘤。腫瘤形成約10~14天后，用μCT測量初始腫瘤體積，每天口服阿來替尼或灌胃稀釋劑，每周測量腫瘤體積。在所有三個模型中，阿來替尼使腫瘤顯著縮小(圖2a)。通過μCT成像，在治療2周后，患者的DepOR達到了最大(圖3a)。EA2的DepOR最大，其次是EA3，EA1腫瘤收縮最小。3周后，停用阿來替尼，EA1和EA3荷瘤小鼠的腫瘤迅速進展，殘留病變明顯，而EA2荷瘤小鼠則沒有(圖3b)。因此，3-4周的TKI治療可產(chǎn)生不同程度的殘余疾病。
為了測試適應性免疫系統(tǒng)在阿來替尼治療反應中的作用，將小鼠EML4-ALK細胞接種到缺乏功能性T和B細胞的nu/nu小鼠的左肺中。在所有三個EML4-ALK細胞系模型中，開始治療后的3~4周內(nèi)，腫瘤出現(xiàn)了顯著的縮小(圖2b)。EA2細胞也接種到免疫缺陷的Rag1?/?小鼠的原位位置。腫瘤短暫收縮，但腫瘤在開始治療的3周內(nèi)發(fā)生進展。這些數(shù)據(jù)表明，功能性適應性免疫細胞對于阿來替尼的持續(xù)抗癌活性至關重要。在免疫功能正常的小鼠中，EA2和EA3腫瘤的收縮程度更大，而在nu/nu宿主中繁殖的EA1腫瘤，阿來替尼誘導的收縮程度沒有差異(圖3c)。因此，適應性免疫有助于在阿來替尼反應的深度和持久性。
以上結(jié)果支持腫瘤微環(huán)境在介導TKI治療反應中的作用。為了分析對照組和經(jīng)阿來替尼治療的腫瘤的免疫細胞群，采用對阿來替尼表現(xiàn)出部分反應的EA1模型和表現(xiàn)出完全反應的EA2模型。將EA1和EA2細胞植入小鼠體內(nèi)，培養(yǎng)3周，然后用對照組或阿來替尼處理4天。采集患有EA1和EA2腫瘤的C57BL/6小鼠的左肺，并使用多光譜成像(Polaris Vectra)。在未治療的腫瘤中，與EA1相比，EA2腫瘤中觀察到腫瘤浸潤CD8+細胞數(shù)量顯著增加，CD3+ CD8?細胞數(shù)量相當(圖4a)。阿來替尼治療后，EA2腫瘤的CD8+T細胞含量有增加趨勢，但無統(tǒng)計學意義；EA1腫瘤的CD8+或CD4+T細胞含量無變化。對照組EA1和EA2腫瘤的B細胞含量相似，在阿來替尼治療后沒有變化(圖4a)。
為了識別髓系細胞類型的潛在變化，使用流式細胞術。EA1和EA2荷瘤小鼠肺中單核細胞(CD11b+/Ly6C+)含量無差異(圖4b)。與EA1腫瘤相比，對照組EA2腫瘤的肺泡巨噬細胞(MacA：CD11c+/SigF+)和招募單核/巨噬細胞群(MacB：CD11b+/Ly6G?/SigF?)含量增加，阿來替尼治療后，MacA細胞含量降低(圖4b)。相比之下，與EA2腫瘤相比，對照組EA1腫瘤的中性粒細胞(CD11b+/Ly6G+/SigF?)含量升高，而阿來替尼誘導的中性粒細胞數(shù)量減少，接近統(tǒng)計學意義(圖4b)。
最近的研究表明，TKI刺激的IFNγ轉(zhuǎn)錄反應伴隨著趨化因子表達的增加。三株小鼠EML4-ALK細胞系在體外用阿來替尼或DMSO處理，并進行RNA-seq，然后使用GSEA分析。數(shù)據(jù)顯示，多種炎癥相關的Hallmark通路在阿來替尼處理的細胞中富集，與細胞增殖相關的Hallmark通路在阿來替尼處理的細胞中顯著去富集，并進一步支持阿來替尼在三種細胞系中的等效生長抑制作用。
為了探究EML4-ALK系作為原位腫瘤繁殖時趨化因子表達的多樣性，從未處理的EA1和EA2腫瘤中純化出轉(zhuǎn)基因GFP表達小鼠的癌細胞進行RNA-seq分析。如圖5所示，CXCL9和CXCL10這兩種具有T細胞募集功能的趨化因子在EA2腫瘤中的mRNA水平明顯高于EA1。與EA1腫瘤相比，未治療的EA2腫瘤中CCL2和CCL7的表達也更高。相比之下，與招募免疫抑制相關的CXCL1、CXCL2、CXCL12和TGF-β2、趨化因子和細胞因子在EA1腫瘤中的水平高于EA2腫瘤。
特定的趨化因子和細胞因子是組成炎癥相關標志通路的基因的中心。選擇多個趨化因子基因，并通過ELISA檢測阿來替尼治療對其分泌的影響。圖6揭示了阿來替尼刺激分泌多種不同活性的趨化因子，作為抗腫瘤因子和促腫瘤因子。在EA2和EA3細胞中，CXCL10和CCL5對阿來替尼的反應顯著，但在EA1細胞中反應弱。相比之下，阿來替尼誘導的CXCL1、CXCL5和CCL2分泌在骨髓系淋巴細胞募集中的作用在三種細胞系中相似。一般來說，在體外未處理的細胞系中檢測到的趨化因子表達水平非常低，這表明來自小鼠宿主的信號被EA1和EA2細胞明顯整合，以達到在體內(nèi)觀察到的不同水平。
為了探索宿主免疫微環(huán)境與患者ALK靶向TKI反應的相關性，從14例ALK+患者中獲得了在診斷LUAD時和TKI治療前的活檢標本的H&E染色切片。所有患者接受TKI治療。淋巴細胞和中性粒細胞（PMNs）在腫瘤和間質(zhì)室中被定量。腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)和PMN的代表性圖像如圖7a, b所示。結(jié)果值與患者的PFS進行Spearman相關性。PFS與PMN總含量及總PMN與總淋巴細胞之比呈負相關，而與間質(zhì)、瘤內(nèi)或總淋巴細胞含量無顯著相關性(圖7c)。結(jié)果表明，高PMN含量與TKI反應持續(xù)時間縮短有關。
在這篇文章中，作者使用了三種EML4-ALK肺癌小鼠模型來測試宿主免疫在阿來替尼治療反應中的作用。細胞系(EA1，EA2，EA3)在免疫功能正常和免疫缺陷小鼠的肺中原位繁殖，并用阿來替尼處理。μCT連續(xù)測定腫瘤體積，流式細胞術和多譜免疫熒光法測定免疫細胞含量。通過RNA-seq評估對阿來替尼的轉(zhuǎn)錄反應，并通過ELISA檢測分泌趨化因子。所有細胞系在體外和免疫能力小鼠的原位腫瘤中對阿來替尼同樣敏感，表現(xiàn)出持久的收縮。然而，在免疫缺陷小鼠中，所有腫瘤模型在TKI治療后迅速進展。在具有免疫功能的小鼠中，EA2腫瘤表現(xiàn)出完全緩解，而EA1和EA3腫瘤保留了殘余疾病，并在TKI治療終止后迅速進展。治療前，與EA1腫瘤相比，EA2腫瘤具有更多數(shù)量的CD8+ T細胞和更少的中性粒細胞。此外，從未經(jīng)治療的腫瘤中恢復的癌細胞的RNA-seq顯示，EA2腫瘤中CXCL9和10水平升高，EA1腫瘤中CXCL1和2水平升高。對ALK+腫瘤患者治療前活檢的分析顯示，中性粒細胞含量與較短的進展時間有關。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持適應性免疫在TKI反應持久性中的作用，并證明腫瘤微環(huán)境的免疫細胞組成可預測對阿來替尼治療的反應。
