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今天給大家分享一篇發表在Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF:6.081）上的文章:
Metabolism-Associated DNA Methylation Signature Stratifies Lower-Grade Glioma Patients and Predicts Response to Immunotherapy
代謝相關DNA甲基化特征預測低級別膠質瘤患者亞型以及免疫治療反應
一．研究背景
低級別膠質瘤（LGG）是常見的原發性顱內腫瘤，具有高復發率、高死亡率和高異質性。由于腫瘤的高異質性，不同的個體通常具有高度可變的預后和對各種類型治療的不同反應。盡管世界衛生組織（WHO）的分類納入了分子標記，如異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變、染色體1p/19q聯合性缺失和TERT啟動子突變，這大大改善了膠質瘤患者的分層，但膠質瘤的異質性仍需進一步闡明。代謝重編程是癌癥的標志。它以多種方式影響癌細胞的增殖、遷移和侵襲，例如滿足癌細胞的能量需求，并通過改變底物水平影響各種生物過程。表觀遺傳修飾是在不改變DNA序列的情況下調節基因表達的過程。它是可塑的、可遺傳的，在細胞分化和細胞功能中起著關鍵作用。最近的研究表明DNA甲基化（DNAm）作為表觀遺傳修飾的一種重要形式，已被證明參與致癌過程。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶（DNMT）的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳位共價鍵結合一個甲基基團，而去甲基化過程則由TET酶介導。除了DNMT和TET酶外，甲基化也可以由代謝調節，它們密切相關。最近的進展揭示了癌細胞中代謝和DNAm之間的相互調節關系。一方面，代謝變化可以通過改變底物水平影響DNAm。例如，在IDH突變腫瘤中，三羧酸循環中產生的異常代謝物2-羥基戊二酸（2-HG）可以抑制TET介導的DNA去甲基化，從而導致基因組甲基化。S-腺苷甲硫氨酸（SAM），在單碳代謝過程中產生，如蛋氨酸循環和葉酸循環是調控DNA甲基化的主要方式，低葉酸飲食據報道會導致DNA低甲基化并增加腫瘤形成的風險。另一方面，DNAm通過影響染色質結構和轉錄因子結合來調節代謝相關基因的表達。以上關于代謝和DNA甲基化的研究主要集中在DNA甲基化上特定代謝物的調節機制研究，并結合轉錄組學和代謝組學去探索腫瘤的代謝異質性。目前，還沒有文章表述過代謝與DNA甲基化相互作用在癌癥患者分層中的作用。
二．研究方法
在本研究中，旨在研究代謝相關DNAm在LGG分層中的價值。研究者對來自TCGA、GEO和CGGA數據庫以及獨立隊列（Qilu cohort）的甲基化數據和轉錄組數據進行了綜合分析。評價DNAm與代謝的相關性。確定了三個具有不同代謝相關DNAm模式的LGG亞型。此外，研究者還構建了一個與亞型相關的、可量化的CpG信號，以對患者預后進行分層，并預測對免疫檢查點抑制劑（ICI）治療的潛在反應，為精準醫學提供了一種新的生物標志物。
三．研究結果
1、LGG中代謝相關DNAm模式的鑒定
作者構建流程圖來演示工作流程（圖1A），他們共獲得了708個代謝通路-CpGs對，包括35條代謝通路和391個CpGs。基于391個CPGs，對TCGA隊列進行了k均值聚類。根據CDF，選擇k=3作為最佳聚類數（圖1B）。如熱圖所示（圖1C、D），501例LGG患者被分為三個不同的亞組。然后應用Kaplan-Meier分析來研究哥亞組的預后意義。結果顯示，三個亞組之間的OS存在顯著差異（圖1E）。為了進一步驗證這種甲基化模式的預后意義，隨后對GEO隊列（GSE48461和GSE104293）進行分型以及Kaplan-Meier分析也顯示了各個亞組之間無進展生存率（PFS）的顯著差異（圖1F）。此外，進行PCA分析以進一步驗證TCGA和GEO隊列的亞型分組（圖1G）。
2. 不同的LGG亞型呈現不同的生物學特征
隨后，研究者探索了每個亞型的代謝特征。首先，從先前發表的研究中獲得了114個代謝特征。使用GSVA算法來量化114個代謝特征。然后，進行差異分析以確定亞組特異性代謝特征。最終，確定了31個亞組特異性代謝特征（圖2A）。亞組1、亞組2和亞組3分別具有13、3和31個亞組特異性代謝特征。亞組1在谷氨酰胺和谷氨酸代謝以及脂質代謝特征得分較高。值得注意的是，第3亞組的31個亞組特異性標記中有8個與聚糖代謝相關，如糖胺聚糖降解。基于這一結果，進一步研究了亞組3是否具有更活躍的糖基化過程，這一過程已被證明在各種類型的腫瘤疾病中促進惡性。正如預期的那樣，發現第3亞組糖基化過程的GSVA得分顯著高于其他亞組（圖2B）。為了進一步闡明每個亞組的潛在生物學特征，在亞組之間進行了GSEA。結果表明，預后最差的第3亞組顯著豐富了細胞周期和免疫相關過程（圖2C）。與亞組1相比，亞組2預后處于中等狀態，主要集中在胚胎發育相關過程中（圖2D）。
3. LGG亞群與臨床和分子特征的相關性
研究者還研究了三個亞組與LGGs常見臨床特征/分子亞類之間的關系，包括組織學分級、IDH突變、MGMT啟動子甲基化、TERT啟動子突變等（圖2H）。在TCGA隊列中，發現第1亞組僅由IDH突變體LGG組成，與1p/19q聯合缺失、PN轉錄表型、TERT啟動子突變等密切相關。在TCGA群組的IDH突變型LGG中，第2亞組與染色體1p/19q非聯合缺失和G-CIMP-high亞型顯著相關。亞組3與組織學III級、甲基化MGMT啟動子、染色體1p/19q非聯合缺失和G-CIMP-low表型密切相關。在TCGA隊列的IDH野生型LGG中，第2亞組與組織學II級、PA-like亞型和NE轉錄亞型相關，而第3亞組與7號染色體的擴增/ 10號染色體缺失、TERT啟動子突變、EGFR擴增，以及classic-like和mesenchymal-like亞型。為了探討不同的亞組是否伴有不同的免疫浸潤水平，量化了每個亞組的免疫浸潤豐度。因此，各亞組之間的免疫評分、基質評分和綜合評分存在顯著差異，第3亞組得分最高，第2亞組次之，第1亞組得分最低（圖2E-G）。
4. 代謝相關CpG特征的構建
為了簡化實際應用中的分組，研究者構建了代謝相關CpG特征的分組相關評分方案。為了構建特征，首先對代謝相關CpG亞組進行差異甲基化分析。在所有可能的比較中差異甲基化的CpG被認為是亞組相關CpG。最終，確定了213個與亞組相關的CpGs（圖3A、B）。接下來，對這些亞組相關CpGs進行Lasso回歸分析（圖3C）。結果生成了由七個CpGs組成的CpG特征（圖3D）。計算了所有TCGA樣本的風險得分。分析表明，風險評分在三個亞組之間的分布存在顯著差異。大多數第3分組LGG被分配到高風險組，而第1分組和第2分組LGG大部分被分配到低風險組（圖3E、F）。然后評估了該特征的預后意義。TCGA隊列首先分為高風險組和低風險組。生存分析證實該特征可以對LGG患者的預后進行分層（圖4A）。ROC曲線表明，該特征具有很強的預測能力（預測3年生存率為0.853，預測5年生存率0.815），并且表現優于常見的臨床特征，如IDH突變、分級和年齡（圖4B）。
5. CpG特征的外部數據驗證
接下來，在GEO和CGGA隊列中進行外部驗證。研究者計算了GEO隊列中所有患者的風險分數，并將他們分為高風險組和低風險組。Kaplan-Meier分析證實了該特征的預后意義（圖4C）。雖然ROC分析顯示，代謝CpG特征在預測3年PFS方面具有良好的預后能力（AUC=0.747），但在預測5年PFS（AUC=0.66）方面表現不佳，但其表現優于常見臨床特征，如年齡、分級和IDH突變（圖4D）。隨后也在CGGA隊列中進行間接外部驗證，以構建基因特征作為替代。具體而言，篩選了與風險評分呈強線性相關的基因，然后使用Lasso回歸將這些基因與風險評分進行擬合。隨后，生成了代替CpG特征，由48個基因組成的基因特征（圖4E）。使用該替代基因特征計算的風險得分與使用CpG特征計算的得分具有很強的相關性（圖4F）。然后，使用基因特征計算CGGA隊列的風險得分。Kaplan-Meier分析（圖4G）和ROC曲線（圖4H）分析結果與TCGA數據集基本一致；預測3年OS的AUC為0.83，預測5年OS的AUC為0.754。結果表明，該特征適用于更廣泛的隊列。
6. 代謝CpG特征的表征
研究者研究了風險評分與常見預后變量或分子亞類的相關性，包括組織學分級、IDH突變等。觀察到，風險評分在按這些常見變量或子類別分層的亞組之間的分布存在顯著差異（圖5A-H）。該特征能夠進一步分層這些分層的亞組（圖6A-L）。為了更好地理解代謝CpG特征的生物學基礎，對每個CpG進行了功能表征，發現cg10054641位于基因啟動子區，位于TMEM71的TSS200。為了研究cg10054641是否調節TMEM71的表達，計算了cg1005464甲基化與TMEM71表達之間的Kendall相關性。結果顯示出強烈的負相關性，表明cg10054641負調節TMEM71的表達（圖7G）。為了對位于非啟動子區的特征性CpG進行功能分析，篩選了與這些CpG具有強相關性的基因，并進行了GO富集分析。結果顯示，cg00347746與主要與正常細胞功能相關的基因相關，如突觸活動（圖7A），cg00301239與參與細胞分化、增殖和RNA處理的基因相關（圖7B），cg02518245、cg04003582、cg25205489和cg27305460與RNA代謝相關的基因相關（圖7C-E）。接下來，使用“limma”R軟件包，對高危組與對照組進行了差異表達分析。在兩組之間確定了2028個DEG。在根據這些DEG的logFC值對其進行排序后，對這些DEG進行了GSEA。結果顯示，高危人群的細胞周期和免疫相關過程顯著豐富（圖7H）。
Qilu cohort的免疫組織化學結果還顯示，風險評分較高的腫瘤更有可能具有較高的Ki-67陽性率，進一步證實了風險評分與增殖活性相關（圖8A）。活躍的細胞有絲分裂與高突變負荷和免疫浸潤相關。為了研究不同風險群體的突變特征，對來自TCGA隊列的體細胞突變數據進行了分析。發現高風險組和低風險組之間的突變頻率存在顯著差異（圖8B）。與低風險組相比，細胞增殖活躍的高風險組與更高的突變頻率顯著相關。接下來，還探討了高危組和低危組的突變模式。結果發現高風險組和低風險組之間存在明顯的突變模式。IDH1、ATRX、CIC、FUBP1和NOTCH1在低風險組中具有顯著較高的突變率，而TTN、EGFR和PTEN，NF1（36.6 vs.4.7%，p<0.001）在高危組中具有顯著較高的突變率（圖8C）。
7. 代謝CpGs特征預測免疫浸潤和潛在的免疫治療反應
還評估了代謝CpG特征與免疫浸潤之間的關聯。首先，使用MCP-Counter量化了8個主要免疫亞群，并研究了它們與風險評分的相關性。注意到風險評分伴隨著明顯的免疫浸潤。與低風險組相比，高風險亞組的抗腫瘤細胞亞群（如T細胞和CD8 T細胞）浸潤水平顯著較高（圖9A）。接下來，用ssGSEA算法量化了28個免疫亞群。觀察到類似的結果。高危組的活化CD4 T細胞、活化CD8 T細胞、激活樹突狀細胞、中樞記憶CD8 T淋巴細胞等水平顯著升高（圖9B）。免疫檢查點在調節免疫細胞功能中起著重要作用。靶向ICIs的治療被認為是最有前途的抗腫瘤治療。鑒于代謝CpG特征伴隨著不同的突變負荷和免疫浸潤模式，這是ICI治療反應的預測因子，假設代謝CpG特征也可能與ICI治療的反應相關。因此，探討了高風險組和低風險組之間不同的免疫浸潤模式是否伴隨著ICI水平的差異。與低風險組相比，高風險組的PD-L1（CD274）、CTLA-4和HAVCR2水平顯著較高（圖9D）。此外，使用IPS算法量化了潛在的免疫治療反應，發現高危組的IPS顯著升高，這表明高危組患者更有可能對免疫治療產生反應（圖9C）。總的來說，代謝CpG特征可以作為預測患者對ICI治療反應的生物標志物。
四、總結
綜上所述，該工作從轉錄組數據和甲基化數據的角度探討了代謝重編程與DNA甲基化之間的關系，并基于這種關系進行了分析。確定了LGG中三個代謝相關的DNA甲基化亞組，并構建了一個CpG特征，以對預后進行分層并預測對ICI的反應。該文章逐步闡述各個不同亞型之間的特征，即使沒有進行了濕實驗驗證，但文章故事邏輯清晰合理，所以也可以發到6+。
