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在上一篇文章(熱點剖析：免疫細胞代謝研究—不看后悔系列)中說到，本小編接下來想避開單細胞測序來寫東西了，要不然一直做單細胞測序的解讀會有點油膩。其實如今每年都有許多新技術的出現，但大多只是適用于某一個研究領域或者說某一些領域，因此像單細胞測序這樣影響力大、適用性強的技術真的是少之又少。既然說少，肯定還是有滴，那么今天咱們不說三國，也不說水滸，就來說一款可以和單細胞測序叫板的技術——質譜流式技術。
還記得小編第一次接觸它是來源于一張圖(圖1)，作為一個還算可以的單細胞測序數據分析的玩家，小編一看就覺得這是一張基于單細胞測序數據做出的圖，以至于當時覺得圖例說什么流式技術是寫錯了。后來通讀了全文后發現，還是自己孤陋寡聞了，它果然是一種叫做質譜流式技術的產物。
圖1：
首先呢，普及一下質譜流式的基礎知識。質譜流式技術是近來年發明的一門新興技術，它利用金屬同位素標簽替代熒光標簽，并利用質譜對標簽進行定量，通過結合質譜和流式細胞技術，可以同時對單細胞進行超多參數、無需補償的測量，大大增強了評估復雜細胞系統和過程的能力，彌補了熒光流式的不足。其高通量、高靈敏度和高穩定性的特點尤其適合于免疫、腫瘤、血液、藥物和遺傳學等學科的研究中。
質譜流式技術從最開始投入到科研到現在也有一些年頭了，運用的也越來越廣泛。如果說普通的流式技術是免疫學的靈魂，那么質譜流式技術就相當于給免疫學加了血肉之軀，使得免疫學在整個生命領域的作用越來越重要(有專業自吹的嫌疑)。當然小編說這話得有所依據，不能僅憑自己平時閱讀文獻老是碰到它，要不然很容易啪啪打臉，于是簡單去谷歌了一下，還真不少。那么就簡單列出幾篇高分文章吧，只有這樣才算有理有據，于是先整上一套CNS（圖2）。
圖2：
好了，講到這大家也知道你點進來看是對了，但小編寫文章一直追求是要給讀者帶來一些不一樣的收獲，但上面哪篇文章做的內容都比較復雜，不好下嘴，大家讀起來也不太容易理解，于是下面就挑了兩篇影響因子稍微低一點的文章進行解讀。
第一篇是今年發表在immunity(IF:31.7)的一篇文章，篇名是“Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated CD8+ T cells during the primary immune response”。從篇名就可以看出這是一篇研究腫瘤微環境中免疫細胞代謝的文章，通過標志代謝相關蛋白的質譜流式技術揭示初始免疫應答下CD8+ T細胞的代謝模式。
1.用質譜流式監測細胞代謝模式的可行性
從第一張圖我們就可以看出，作者應該是性情中人，怕讀者看不懂后面的流程，先給普及一下CD8+ T細胞的調控網絡和關鍵標志蛋白(圖3).這兩張圖乍一看是挺復雜的，各種信號的受配體以及調控代謝的關鍵基因共同維持著CD8+ T細胞的正常功能。其實簡單來說就是CD8+ T細胞在被抗原刺激活化后，由TCR信號介導的一系列由外向內的調控網絡，表現為在不同細胞狀態下膜表面相關蛋白的高表達。同時也是為了告訴讀者，可以通過檢測關鍵蛋白的表達來揭示CD8+ T細胞的代謝狀態，不同的代謝狀態也預示著細胞的不同功能，二者是相輔相成的。
圖3：
如果只是檢測某幾個蛋白，普通的流式細胞術就能滿足需要，但是由于細胞的代謝流變化迅速且牽涉較多的代謝調控基因和酶，那普通的流式就顯得有心無力了。于是，主角登場，質譜流式它來了。相較于普通的流式細胞術，質譜流式可以最多同時檢測100種胞內和胞外蛋白。同時，因為是使用重金屬作為標記物，大大降低了光譜流式細胞術每段光波之間補償較大的問題，于是能更清楚的區別各種細胞亞群。
2. 質譜流式揭示單個CD8+ T細胞代謝表型及調控因子
為了從生理學的角度探索CD8+ T細胞分化期間的代謝變化，研究人員利用Lm-OVA(一種細菌)感染C57BL/6小鼠評估了體內急性感染反應的軌跡，該分析揭示了在對單核細胞增生李斯特菌的主要免疫應答過程中，所有主要典型T細胞亞群的異質性和動態功能變化。接下來通過使用標記40種蛋白，對各個狀態下的CD8 T細胞進行標記，并基于tSNE算法繪制出全文最炫的一張圖(圖4)，有點像一個斧子，區分度一點不比單細胞測序的數據差。
圖4：
研究發現，大多數幼稚細胞都包括Na?ve 1細胞亞群，主要表現為較低表達的ACADM、 pCREB、 p-p38和 NRF1。在感染的前兩天，三種幼稚細胞都有表達。在感染的第四天，Na?ve 4細胞亞群開始表達。值得注意的是，從感染6天及之后，Na?ve 1細胞亞群占比開始升高成為主要的幼稚細胞亞群，其他三種細胞幼稚細胞表達退化。該結果揭示了這些細胞所承擔的代謝適應性，并驗證了幼稚T細胞的新陳代謝靜息圖譜。
第一張圖主要是對na?ve T細胞的代謝模式進行揭示，下面就是分別對其它類型的CD8+ T細胞進行研究，感興趣的小伙伴可以去看看原文，小編這里就略過了。下面直接講全文的另一大亮點，設計CAR T研究了抗原特異性 T 細胞在人體免疫反應過程中的代謝動力學。
3.對惡性腫瘤反應的CAR T細胞代謝動力學
研究發現在輸注細胞后，采用轉移的CAR T細胞表現出與小鼠早期活化T細胞類似的代謝動力學，具有高峰氧化和糖酵解相關蛋白的表達。而在治療后7天，大多數代謝蛋白質表達減少。 另外，值得注意的是，相關性分析表明在輸注時氧化磷酸化和糖酵解蛋白之間存在正相關，這表明這些過程并不是互相排斥的。此外，與感染小鼠感染模型一致，在這種早期激活狀態下，ICOS也是CD8+ CAR T細胞高表達的關鍵標志蛋白。
圖5：
下面總結一下，這項研究采用了質譜流式細胞技術，在單細胞分辨率下量化代謝相關調節因子的同時，進行細胞信號轉導、增殖以及效應功能的研究。研究揭示了早期活化T細胞獨特的代謝狀態，其特征在于糖酵解和氧化代謝蛋白的最大程度表達。特別是在感染后5天，處于這種瞬時狀態的細胞最為豐富，隨后代謝相關蛋白迅速降低。研究人員在晚期淋巴瘤患者的CAR T細胞中觀察到類似的結果。該研究證明了通過質譜流式來進行單細胞代謝分析，以在體內識別免疫細胞亞群的代謝適應實用性，并為研究各種應用中免疫應答的代謝調節提供了參考。
4.質譜流式探索晚期肝癌綜合免疫學特征
上一篇講的是今年剛發表的比較有研究意義的一篇基于質譜流式的研究文章，今年還有很多類似的文章，但更多的是將質譜流式運用到其中一個環節。既然篇名為高分文章簡單做，那下面就要講一篇簡單到不能再簡單，設計也很通俗易懂的文章。
第二篇文章解讀的是2020年發表在J Immunother Cancer(IF:13.7),篇名為“Integrated immunological analysis of a successful conversion of locally advanced hepatocellular carcinoma to resectability with neoadjuvant therapy”。如何簡單呢，全文就四張圖，而且就只做了一個事情：利用質譜流式技術和成像質譜流式技術，對治療后的手術切除腫瘤樣本和治療前后的血液樣本進行了綜合免疫分析。全文可以說沒有任何設計可言，也很通俗易懂，感興趣的小伙伴可以下載原文放一下，同樣小編也放一張很美觀的一張圖(圖6)，主要是左半邊哈。
圖6：
這項研究結果表明，聯合新輔助治療可導致免疫細胞的成功募集，淋系細胞和髓樣細胞彼此間或與間質細胞間的共浸潤是以一種非隨機的、協調的方式發生的。研究人員計劃在這個正在進行的試驗中，用同樣的質譜流式和IMC聯合方法對每一位患者進行分析，以推動進一步的研究發現。
5.小結
就像最開始流式細胞術還沒有普及的時候，有一些實驗室隨便用流式檢測一些細胞的表面蛋白就能發表不錯的文章，如今的質譜流式技術仍然處在這樣的一個紅利期。但是目前它的價格還是比較昂貴的，大概5千左右一個樣品，一般需要3個生物重復，因為要用到很多針對不同蛋白的抗體，所以這個費用短期內不會降下來。從這方面講，這項技術就對一般實驗室的科研人員不太友好，但是，但是，悄咪咪告訴你，質譜流式數據也是可以挖掘的。
和單細胞數據一樣，一般雜志在接收之前碰到做質譜流式的文章，都是要求把數據傳到數據庫中。因此只要有相關領域的文章做過質譜流式，那完全是可以把數據下載下來支持自己的研究的。分別推薦大家一個網站(http://flowrepository.org)和一個包(CytofWorkflow)，這是用來下載質譜流式數據的網站和分析質譜流式數據的R包，大家趕緊用起來吧！！
[參考文獻]
1. Wagner J, Rapsomaniki MA, Chevrier S, Anzeneder T, Langwieder C, Dykgers A, Rees M, Ramaswamy A, Muenst S, Soysal SD, Jacobs A, Windhager J, Silina K, van den Broek M, Dedes KJ, Rodríguez Martínez M, Weber WP, Bodenmiller B. A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer. Cell. 2019 May 16;177(5):1330-1345.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.005.
2. Rendeiro AF, Ravichandran H, Bram Y, Chandar V, Kim J, Meydan C, Park J, Foox J, Hether T, Warren S, Kim Y, Reeves J, Salvatore S, Mason CE, Swanson EC, Borczuk AC, Elemento O, Schwartz RE. The spatial landscape of lung pathology during COVID-19 progression. Nature. 2021 May;593(7860):564-569. doi: 10.1038/s41586-021-03475-6.
3. Arunachalam PS, Wimmers F, Huerta C, Paine McCullough M, Lv H, Anderson E, Edupuganti S, Upadhyay AA, Bosinger SE, Maecker HT, Khatri P, Rouphael N, Peiris M, Pulendran B. Systems biological assessment of immunity to mild versus severe COVID-19 infection in humans. Science. 2020 Sep 4;369(6508):1210-1220. doi: 10.1126/science.abc6261.
4. Levine LS, Hiam-Galvez KJ, Marquez DM, Irish JM, Oluwole OO, Rathmell JC, Spitzer MH. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated CD8+ T cells during the primary immune response. Immunity. 2021 Apr 13;54(4):829-844.e5. doi: 10.1016/j.immuni.2021.02.018.
5. Ho WJ, Sharma G, Zhu Q, Stein-O'Brien G, Yarchoan M. Integrated immunological analysis of a successful conversion of locally advanced hepatocellular carcinoma to resectability with neoadjuvant therapy. J Immunother Cancer. 2020 Nov;8(2):e000932. doi: 10.1136/jitc-2020-000932.
