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顱咽管瘤(Craniopharyngioma,CP)是一種組織學上良性但臨床上十分具有挑戰性的腫瘤。今天小編要和大家介紹的是一篇21年12月剛剛發表在Molecular Cancer（IF:27.401）雜志上的全基因組測序（WGS）CP分析突變的文章。分析突變的文章有很多，但這篇文章影響因子卻達到了27+，相信小伙伴們也很好奇這篇工作的內容。接下來就讓小編帶大家看看這篇高分文章的廬山真面目吧，小伙伴們不要錯過這個高分思路呀。
Characterization of novel CTNNB1 mutation in Craniopharyngioma by whole-genome sequencing
全基因組測序刻畫顱咽管瘤中CTNNB1突變
一．研究背景
顱咽管瘤(CP)是一種少見的原發良性腦腫瘤，與視神經、下丘腦、頸內動脈等重要功能結構毗鄰，因此臨床治療十分具有挑戰性。此外，CP可分為兩個主要的組織學亞型:ACP和PCP。先前已經有研究揭示了這兩類腫瘤都存在一些基因組上的畸變，但目前為止，該腫瘤基因改變的完整譜系仍然是未知的。因此今天分享的文章就對CP進行了全基因組測序，進而對突變進行了全面刻畫。
二．數據及方法
1. 臨床樣本：研究納入2014年1月至2015年7月華西醫院組織學診斷為顱咽管瘤的26例患者（CPs）包括16例ACP和10例PCP患者，也收集了這些樣本的年齡和性別。
2. 全基因組測序（WGS）：研究對樣本進行了全基因組測序，將DNA剪切至300-400bp的大小并對DNA片段純化，測定測序文庫的DNA濃度，分析測序文庫的數量和大小，最后進行聚類及對端測序。
3. 數據處理及體細胞突變檢測：針對WGS結果，研究將原始reads轉化為FASTQ，然后用BWA-MEM算法與人類參考基因組(hg19)進行比對。使用基因組分析工具包(GATK 3.8)進行重復reads去除、局部重組和基礎質量調整。堿基替換由muttect2和Strelka2分析，而缺失由Strelka2和Varscan2分析。然后利用正常血液樣本WGS數據構建的基因座背景對得到的初始體細胞變異集進行篩選，其中低復雜度區域(如串聯重復序列區域)的突變被過濾掉。最后，Mutect2的體細胞變異都被保留，而只在Strelka2或Varscan2 的體細胞變異被過濾，體細胞重排用Manta分析。然后使用IGV觀測重排，去除假陽性事件。用Sequenza評估腫瘤純度和倍性。
4. Kataegis分析：文章用regioneR和karyoploteR兩個R包對全部小突變進行Kataegis分析，用指定顏色繪制不同類型的突變。
5. 突變特征分析：用DeconstructSigs分析突變特征。先前在成人和兒童腦癌中識別和驗證了COSMIC特征1/5/6/11/14和1/5/8。文章首先計算了這6個突變特征對每個樣本的相對貢獻。此外，由于之前沒有對CP 進行過WGS分析，因此作者將30個COSMIC特征全部考慮在內，計算它們對CP的貢獻。
6. 實驗分析：原代細胞培養、細胞培養和病毒制備、RT-qPCR、蛋白免疫印跡、免疫沉淀反應(IP)分析、CCK-8實驗、克隆形成實驗、免疫組化、熒光原位雜交。
三．研究的主要內容及結果
1. CP基因組的體細胞突變總述
在文章的第一部分作者對CP基因組的體細胞突變總體刻畫。研究共對26個CPs進行了全基因組測序，最終檢測到20772個體細胞突變，包括SNVs(單核苷酸變異)和InDels(插入和缺失)，平均每個患者有760個SNVs和39個InDels(圖1a)。與其他類型腫瘤相比，CPs中腫瘤突變負荷（TMB）相對較低，與其組織良性一致，且突變大多發生在基因間區，其次是內含子區(圖1b和c)。而只有243個體細胞突變發生在211個基因的編碼區域內(圖1d)。對所有體細胞SNV和InDels的kataegis分析表明，突變傾向于發生在染色體末端(圖1e)。此外，作者也發現CP基因組的染色體末端的頻繁體細胞突變更靠近端粒區。這表明即使在良性腫瘤中，靠近端粒的區域也容易受到DNA損傷。
2. 突變譜與特征
在文章的第二部分作者對CPs進行了全基因組突變譜分析，發現C:G>T:A轉換和T:A>C:G轉換是隊列中的主要替換(圖2a和b)。接著作者使用deconstructSigs分析隊列的突變特征，先前在成人和兒童腦癌中識別和驗證了COSMIC特征1/5/6/11/14和1/5/8。文章首先計算了這6個突變特征對每個樣本的相對貢獻。結果從圖2c中可以看出，除了特征14外，這些特征對CPs的突變過程貢獻很大，而特征5對CPs的貢獻最大。此外，年齡相關特征1也在22個CPs中被發現（圖2d）。
3. 蛋白質編碼區的體細胞突變
在這一部分，作者分析了蛋白質編碼區的體細胞突變。在211個蛋白編碼區突變的基因中，在至少2個患者或COSMIC Cancer Gene Census中列出的突變基因如圖3a所示，其中與之前的報道一致，CTNNB1突變和BRAF V600E突變在ACP和PCP中互斥。作者也發現16個ACPs中有11個在CTNNB1基因外顯子3發生突變(圖3b)。此外，在PCPs中，10例患者中有7例檢測出BRAF V600E突變(圖3a)。作者也在CP33中發現了FBXW7 WD40結構域內的一個新的無意義突變。為了驗證這一點，作者采用FISH技術檢測患者FBXW7 mRNA水平。如圖3c所示，CP33中FBXW7的mRNA水平確實低于CP12 FBXW7-wilt型的水平，說明這種突變的mRNA可以被NMD降解。
4. CTNNB1 - Mut增加β -catenin蛋白穩定性
如上所述作者從WGS結果中發現患者CP111的CTNNB1外顯子3 有一個新的突變(圖3b)， 且Sanger測序進一步證實了這一點（圖4a）。該突變包括39個核苷酸的缺失和一個錯義替換，從而導致13個氨基酸殘基缺失和p.A43G的改變(圖4a)。因此，在這一部分作者進行了實驗驗證及探索突變的生物機制。由于制備人ACP原代細胞比較困難，且沒有可用的ACP培養細胞，作者首先選擇HEK293T(正常細胞)和HCT116細胞(結直腸癌細胞)進行研究。為了防止內源性β-catenin對突變體功能的影響，在HEK293T和HCT116細胞中，內源性β-catenin被短發夾RNA (shRNA)敲掉(圖4b)。然后作者在β-catenin敲除細胞中建立表達耐shRNA的野生型或β-catenin突變型細胞系，分別命名為CTNNB1-WT或CTNNB1-Mut細胞。結果觀察到CTNNB1- Mut細胞的β-catenin水平高于CTNNB1- WT細胞(圖4c)。β-catenin的增加可能是由于其mRNA或蛋白穩定性的改變引起的。為了驗證這一點，作者用放線菌素D處理HEK293T及HCT116穩定細胞，終止不同時間的基因轉錄，然后測量β-catenin mRNA水平。結果表明，WT與突變體β-catenin mRNA的半衰期沒有顯著差異，說明該突變體對其mRNA的穩定性沒有影響。接下來，作者在不同時間用蛋白質合成抑制劑CHX處理細胞，然后進行蛋白免疫印跡檢測其蛋白質穩定性。如圖4d所示，CTNNB1- Mut細胞對β-catenin的降解比WT細胞慢，這表明CTNNB1的這種新突變增加了β-catenin的穩定性。由于這種新的CTNNB1突變導致了CK1α磷酸化的Ser45殘基丟失，所以突變β-catenin的Ser45磷酸化狀態幾乎沒有檢測到(圖4e)?？紤]到Ser45磷酸化對β-catenin的多聚泛素化和隨后的蛋白酶體降解至關重要，作者用免疫沉淀野生型或突變型β-catenin來檢測其泛素化狀態。結果發現突變體β-catenin的多聚泛素化顯著低于野生型(圖4f)。因此作者推測這種新的CTNNB1缺失突變通過泛素化-蛋白酶體系統破壞β-catenin蛋白的降解，從而增加β-catenin蛋白的水平。
5. CTNNB1 - Mut促進Wnt/β - catenin信號通路
先前研究已經發現積累的胞質β-catenin會易位到細胞核與T細胞因子及淋巴增強結合因子(TCF/ LEF)轉錄因子相關，進而促進Wnt靶基因的轉錄。在這一部分作者為了確定CTNNB1-Mut是否具有轉錄活性，進行了TCF/LEF反應熒光素酶檢測來實驗驗證。結果顯示，無論是CTNNB1- Mut還是CTNNB1- WT都能刺激HEK293T細胞(圖4g)和HCT116細胞(圖4h)的TOP-FLASH轉錄，說明這個β-catenin突變仍然保持其轉錄功能。由于CTNNB1-Mut通過延長其蛋白半衰期來增加β-catenin的表達(圖4d)，因此CTNNB1-Mut的活性升高在兩種細胞中均遠高于CTNNB1-WT(圖4g和h)。此外，作者也檢測了Wnt/β-catenin靶基因如c-Myc和SOX9的表達水平。結果發現，與CTNNB1-WT組相比，CTNNB1-Mut細胞中c-Myc和SOX9的表達顯著升高(圖4i)。因此，本研究中發現的CTNNB1突變使其蛋白穩定，從而增強其下游靶點的表達。
6. CTNNB1 - Mut通過激活Wnt信號通路促進ACP原代細胞增殖
在文章的最后一部分，作者為了進一步探索CTNNB1-Mut在ACP背景下的功能，制備了ACP原代細胞，并比較了野生型和突變型β-catenin的表達。結果與HEK293T和HCT116細胞的結果相同，與野生型相比，這種CTNNB1突變導致了更長的半衰期和更高的β-catenin蛋白水平(圖5a和b)。此外，在MG132處理的原代細胞中，野生型β-catenin的蛋白豐度增加，而突變型β-catenin沒有出現這種現象，表明突變型的降解通路受損(圖5c)。同時，作者也進一步驗證了突變體β-catenin的Ser45磷酸化和泛素化水平在ACP原代細胞中均顯著降低(圖5d和e)，這與之前的結果一致(圖4e和f)。免疫組化分析也發現，在CTNNB1突變的ACP樣本(CP111)中明顯觀察到β-catenin的核免疫陽性，而在沒有CTNNB1突變的ACP樣本(CP121)中幾乎不存在(圖5f)。此外，突變體β-catenin還在ACP原代細胞中激活其已知靶基因(c-Myc和SOX9)轉錄，從而導致其mRNA(圖5g)和蛋白水平(圖5h)的升高。為了研究CTNNB1-Mut對ACP腫瘤發生的影響，作者進行了CCK-8和菌落形成實驗。結果如圖5i和j所示，突變體β-catenin顯著促進ACP原代細胞增殖。綜上所述，這些結果證明CTNNB1-Mut可能通過激活Wnt/β-catenin信號ing通路促進ACP的發生。
到這里這篇文章的主要內容就介紹完了，文章的方法并不復雜，但有理有據，從全基因組測序數據入手，用生物信息學方法多角度分析了突變，并對重要結果進行了實驗驗證?？v觀全文，邏輯清晰，條理明確。如果小伙伴們測序數據有了，卻沒思路的不妨看看這篇文章，其分析角度及敘述方法非常值得我們參考學習。
參考文獻
1. Characterization of novel CTNNB1 mutation in Craniopharyngioma by whole-genome sequencing;
