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空間轉(zhuǎn)錄組研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制，真是適配度極高，思路清晰!作為空間轉(zhuǎn)錄組的頭號(hào)粉絲，小編已經(jīng)于上期（生信人公眾號(hào)，3.23期）分享了高手如何分析“腫瘤”的前世今生！把從癌前病變到惡性腫瘤轉(zhuǎn)化機(jī)制分析，安排的明明白白！
今天小編給大家分享“腫瘤的前世今生之——復(fù)發(fā)機(jī)制”，我們先從一篇高分泛癌分析說起!文章結(jié)尾有彩蛋，重在將高大上的“空間轉(zhuǎn)錄組”思路拆解，好為我們普通人所用，大家不要錯(cuò)過哦!
今天分享的文章于2022年8月發(fā)表在 nature genetics （IF：41.307）， 題目“癌細(xì)胞狀態(tài)在腫瘤類型中反復(fù)出現(xiàn)，并與腫瘤微環(huán)境形成特定的相互作用Cancer cell states recur across tumor types and form specific interactions with the tumor microenvironment”
作者對(duì)15種癌癥類型進(jìn)行了泛癌單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，并確定了一個(gè)基因模塊目錄，其表達(dá)定義了復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞狀態(tài)，包括應(yīng)激、干擾素反應(yīng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、金屬反應(yīng)、基底和纖毛等。通過空間轉(zhuǎn)錄組分析（10x Genomics Visium）和多色免疫熒光（AKOYA CODEX）將腫瘤細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)和腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聯(lián)系起來。利用小鼠模型，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊的誘導(dǎo)因腫瘤位置的不同而異，并在淋巴細(xì)胞消除后減少。本文的發(fā)現(xiàn)拓展了人們對(duì)TME中癌細(xì)胞狀態(tài)與非惡性細(xì)胞類型之間關(guān)系的認(rèn)識(shí)，為研究癌細(xì)胞狀態(tài)如何與腫瘤微環(huán)境相互作用，從而形成能夠進(jìn)行免疫逃避、耐藥和轉(zhuǎn)移的有組織系統(tǒng)提供了一個(gè)框架。
一、背景
癌癥的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性越來越被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療失敗的驅(qū)動(dòng)因素。惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性在一些癌癥類型中得到研究，并被定義為癌細(xì)胞狀態(tài)；然而，目前還不清楚這些狀態(tài)在多大程度上跨越腫瘤類型，構(gòu)成癌癥的一般特征。因此，需要比較不同的腫瘤類型來尋找腫瘤異質(zhì)性的共同點(diǎn)，并系統(tǒng)地研究癌細(xì)胞狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境(TME)中非癌細(xì)胞類型之間的關(guān)系。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序使單個(gè)腫瘤細(xì)胞的無偏倚轉(zhuǎn)錄組分析成為可能，并揭示同一腫瘤的惡性細(xì)胞之間的異質(zhì)性。結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和多色免疫熒光分析使TME的特定細(xì)胞類型與癌細(xì)胞狀態(tài)之間的因果關(guān)系變得更清晰明了。
二、結(jié)果
1、復(fù)發(fā)性腫瘤基因模塊鑒定
作者首先將收集的19例未經(jīng)治療直接手術(shù)切除的新鮮原發(fā)腫瘤，直接進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。收集的腫瘤包括9種癌癥類型:卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、結(jié)腸癌和胰腺癌、胃腸間質(zhì)瘤。既往發(fā)表的腫瘤(包括其他PDAC和LIHC)以及其他腫瘤類型: 如膽管癌、肺腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。接下來借助文獻(xiàn)檢索獲得的細(xì)胞類型標(biāo)志基因及singleR軟件進(jìn)行細(xì)胞類型注釋，區(qū)分惡性細(xì)胞與非惡性細(xì)胞。細(xì)胞主要被注釋為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞。而后，進(jìn)一步借助標(biāo)志基因、異常的拷貝數(shù)狀態(tài)和腫瘤間異質(zhì)性對(duì)惡性細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別（圖1c）。最終結(jié)果得到了來自62個(gè)未經(jīng)治療的原發(fā)腫瘤的共19,942個(gè)惡性細(xì)胞，涉及15種癌癥類型。
接著，作者進(jìn)一步用非負(fù)矩陣分解(NMF)分析惡性細(xì)胞，并通過在基因模塊水平進(jìn)行整合，比對(duì)分析共得到16個(gè)具有跨癌種表達(dá)特征模塊的目錄，模塊中的基因數(shù)量范圍為9~297個(gè)基因。在進(jìn)行跨組織和跨癌種的基因模塊離散度評(píng)估之后，發(fā)現(xiàn)一些模塊在多種不同器官系統(tǒng)的癌癥中被廣泛檢測(cè)到，包括細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、缺氧、氧化磷酸化，以及金屬硫蛋白反應(yīng)。而另一些模塊則顯示器官系統(tǒng)特異性，比如肺泡模塊、纖毛相關(guān)基因模塊、基底細(xì)胞模塊、鱗狀細(xì)胞模塊、腺體模塊、星形膠質(zhì)細(xì)胞樣模塊、少突膠質(zhì)細(xì)胞樣模塊和神經(jīng)祖細(xì)胞樣模塊。此外，還包括2個(gè)與上皮細(xì)胞間質(zhì)化相關(guān)的模塊，即部分間質(zhì)模塊（pEMT）和完全間質(zhì)模塊（cEMT）。表明這些模塊并不是在癌癥中新產(chǎn)生的，而是原本存在于正常組織中，是在正常組織癌變過程中逐漸被選擇出來，并在癌癥中呈現(xiàn)出更多樣化的表達(dá)。
2、基因模塊的表達(dá)是癌細(xì)胞狀態(tài)的基礎(chǔ)
接著作者對(duì)每個(gè)惡性細(xì)胞的每個(gè)模塊的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分(圖2a)，以試圖了解基因模塊如何在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行表征，并基于惡性細(xì)胞的模塊，對(duì)19例本研究測(cè)序的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分?jǐn)?shù)進(jìn)行UMAP降維，然后用每個(gè)癌細(xì)胞中得分最高的模塊對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注釋。結(jié)果表明，癌細(xì)胞不再按照患者個(gè)體或癌癥類型進(jìn)行聚集，而是按照其最高表達(dá)的模塊來聚集（圖2b、2c）。隨后，作者發(fā)現(xiàn)有些模塊呈現(xiàn)共表達(dá)，如pEMT與干擾素反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)模塊共表達(dá)（圖2a、2d）。以上結(jié)果表明，基于基因模塊定義的癌細(xì)胞狀態(tài)通常不代表特定的腫瘤實(shí)體。
由于一些模塊也存在于正常組織中，因而作者比較了正常組織和癌組織中表達(dá)每個(gè)模塊的細(xì)胞比例（圖2e）。觀察到在所有癌癥類型中，pEMT模塊在所有癌癥類型中表達(dá)的比例都大于其正常組織。LUAD、SKSC與其正常組織間鱗狀細(xì)胞模塊的細(xì)胞比例沒有差異，但PDAC中鱗狀細(xì)胞模塊的細(xì)胞比例升高，SKSC中腺體模塊的細(xì)胞比正常皮膚組織的比例高。這些變化都表明，癌癥組織中既保留了正常組織的模塊，又隨著疾病進(jìn)展而表現(xiàn)出其他細(xì)胞類型的模塊。
3、空間腫瘤微環(huán)境探究
為了探究癌細(xì)胞狀態(tài)與TME中細(xì)胞類型的關(guān)系，作者對(duì)收集的10例未治療患者的新鮮原發(fā)腫瘤組織（OVCA∶UCEC∶BRCA∶PDAC∶GIST∶LIHC=2∶1∶3∶1∶2∶1）開展了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。作者使用來自成對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型的平均表達(dá)譜進(jìn)行了非負(fù)線性最小二乘(NNLS)回歸，并將Spot標(biāo)注為“惡性”(僅包含惡性細(xì)胞)、“正?！?僅包含免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞)和“兩者”(包含惡性細(xì)胞，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組合)三個(gè)類型(圖3a)。作者發(fā)現(xiàn)，在含有惡性細(xì)胞的Spot中，內(nèi)皮細(xì)胞的比例較低(圖3b)，提示腫瘤的血管化不完全。相反，“兩者”Spot的中性粒細(xì)胞數(shù)量較多(圖3c)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被廣泛定義為M1(抗腫瘤，促炎)和M2(促腫瘤，抗炎)。對(duì)于每個(gè)含有巨噬細(xì)胞的Spot，作者對(duì)其M1/M2極性進(jìn)行了評(píng)分(圖3d)。在6個(gè)婦科樣本(卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌)中，發(fā)現(xiàn)M1/M2中的“兩者”Spot高于“正常”Spot，這表明在癌細(xì)胞附近具有強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
4、繪制癌細(xì)胞狀態(tài)及其與TME的相互作用
為了探究癌細(xì)胞鄰近區(qū)域的細(xì)胞組成及細(xì)胞間互作，作者描繪了每個(gè)空間轉(zhuǎn)錄組樣本中的癌細(xì)胞狀態(tài)，并根據(jù)每個(gè)模塊的表達(dá)對(duì)每個(gè)“惡性”Spot進(jìn)行評(píng)分(圖4a)。為了表征每個(gè)“惡性”點(diǎn)周圍的細(xì)胞類型組成，作者計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞類型的兩個(gè)評(píng)分指數(shù)，以在捕捉每個(gè)惡性細(xì)胞Spot的微環(huán)境特征。作者將“鄰域分?jǐn)?shù)”定義為包含該細(xì)胞類型的周圍點(diǎn)所占的比例(圖4b)，通過直接量化相鄰點(diǎn)的細(xì)胞類型構(gòu)成來計(jì)算?！敖咏?jǐn)?shù)”的定義是通過的是感興趣Spot離每種類型細(xì)胞的直線距離來量化評(píng)估(圖4c)。
將每個(gè)腫瘤的“惡性”Spot的模塊評(píng)分和細(xì)胞類型的鄰域概況相關(guān)聯(lián)，以此揭示了TME的癌細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型如何共定位形成“鄰域”(圖4d)。對(duì)于圖4a-c所示的BRCA NYU2腫瘤，關(guān)系熱圖中的一組包含干擾素應(yīng)答模塊和巨噬細(xì)胞的定位。這一相關(guān)性的進(jìn)一步研究也證實(shí)了模塊評(píng)分和巨噬細(xì)胞鄰域評(píng)分之間這種正相關(guān)關(guān)系的顯著性(圖4e)。使用接近評(píng)分計(jì)算巨噬細(xì)胞存在時(shí)，也觀察到一致的關(guān)系(圖4f)。為了在所有樣本中探索這一關(guān)系，作者計(jì)算了巨噬細(xì)胞鄰近區(qū)域的相關(guān)評(píng)分(圖4g)。在所有的樣本中，與干擾素反應(yīng)的相關(guān)性都是正相關(guān)的，并且在10個(gè)樣本中有8個(gè)結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)為顯著。
將這一分析擴(kuò)展到使用兩種測(cè)量的所有對(duì)細(xì)胞類型和模塊后(圖4h,4i)，作者發(fā)現(xiàn)與TME細(xì)胞類型一致的其他細(xì)胞狀態(tài)共定位。發(fā)生EMT的癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞呈正相關(guān)，而與其他惡性細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，這也與它們?cè)谀[瘤區(qū)域富集并與癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞相互作用的發(fā)現(xiàn)一致。除巨噬細(xì)胞外，表達(dá)干擾素應(yīng)答的癌細(xì)胞與T細(xì)胞共定位(圖4h,i)。此外，作者還使用能夠在單細(xì)胞分辨率下進(jìn)行空間分析的多重免疫熒光的方法——CODEX進(jìn)行了驗(yàn)證復(fù)現(xiàn)上述結(jié)論。以上結(jié)果都表明癌細(xì)胞狀態(tài)與TME的細(xì)胞組分密切相關(guān)，要么癌細(xì)胞狀態(tài)改變其周圍的細(xì)胞類型組成，要么TME中細(xì)胞類型誘導(dǎo)特定癌細(xì)胞狀態(tài)的產(chǎn)生。
5、腫瘤微環(huán)境擾動(dòng)下的癌細(xì)胞狀態(tài)
為了測(cè)試干擾素反應(yīng)與TME中T細(xì)胞之間的關(guān)系，使用異體移植小鼠模型進(jìn)一步分析。首先，作者在具有正常免疫系統(tǒng)的小鼠腫瘤異體移植模型中進(jìn)行腫瘤組織的scRNA-seq分析，結(jié)果表明，小鼠異體移植模型可以重現(xiàn)癌癥患者腫瘤樣本中存在的5個(gè)基因模塊：細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、缺氧和腺體模塊。接下來，作者在缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞的Rag1-/-小鼠中進(jìn)行腫瘤組織的scRNA-seq分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、缺氧以及腺體模塊的表達(dá)頻率在野生型和Rag1-/-小鼠異體移植模型中沒有差別；與之相反的是，干擾素反應(yīng)模塊的表達(dá)頻率在Rag1-/-小鼠異體移植模型中降低。此外，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊表達(dá)細(xì)胞的頻率也因腫瘤位置而異。這進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證明了干擾素反應(yīng)的癌細(xì)胞狀態(tài)與TME中的T細(xì)胞相互作用。
三、討論和結(jié)論
文章的研究結(jié)果表明，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)錄變異性的基本單位可以被認(rèn)為是基因模塊，模塊間的組合產(chǎn)物定義了不同癌細(xì)胞狀態(tài)。在癌細(xì)胞間觀察到的許多異質(zhì)性似乎是由通常在其他細(xì)胞和發(fā)育環(huán)境中表達(dá)的模塊的重構(gòu)而造成的。相對(duì)于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞利用現(xiàn)有的基因模塊，以不同的水平和更異質(zhì)性的方式重組表達(dá)。 此外，作者發(fā)現(xiàn)參與干擾素應(yīng)答的基因在該研究所囊括的15種癌癥類型的惡性細(xì)胞中被協(xié)同調(diào)節(jié)和異質(zhì)性表達(dá)，表明這種干擾素應(yīng)答特殊表達(dá)的癌細(xì)胞狀態(tài)的存在是腫瘤發(fā)生的一個(gè)必要特征。本研究中對(duì)多種癌癥類型的癌癥狀態(tài)的觀察提供了證據(jù)，表明癌癥細(xì)胞狀態(tài)不是由遺傳定義的，而是其自身可塑性而導(dǎo)致的。雖然體內(nèi)的各癌細(xì)胞具有高度的可塑性，但它們的整體分布卻仍具有穩(wěn)定整體的特點(diǎn)。
思維擴(kuò)展
小編來放彩蛋啦!大家發(fā)現(xiàn)了嗎，可以用的基因集又又又更新了?。?/strong>
“作者確定了一個(gè)基因模塊目錄，其表達(dá)定義了復(fù)發(fā)的癌細(xì)胞狀態(tài)，包括應(yīng)激、干擾素反應(yīng)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、金屬反應(yīng)、基底和纖毛等”，既然是定義了腫瘤“復(fù)發(fā)”的基因集，那么就可以挪用到自己文章中，基于上述基因集表達(dá)情況，分析腫瘤復(fù)發(fā)傾向，是不是so easy!
當(dāng)然，這只是開胃小菜！小編今天給大家整理了腫瘤空間轉(zhuǎn)錄組分析的一套流程，趕緊收藏吧！
腫瘤異質(zhì)性：腫瘤的發(fā)生、生發(fā)展及對(duì)藥物的反應(yīng)等，進(jìn)而推進(jìn)腫瘤的治療。
腫瘤微環(huán)境：動(dòng)態(tài)分析腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程重設(shè)計(jì)的機(jī)制，，對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義；
細(xì)胞互作：免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等與腫瘤細(xì)胞的相互作用，免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞中起到作用的具體機(jī)制，為免疫治療療效預(yù)測(cè)和開發(fā)新型免疫療法提供重要依據(jù)。
臨床用藥指導(dǎo)：依托精確的細(xì)胞分型的功能，推動(dòng)精準(zhǔn)治療的發(fā)臨床用藥指導(dǎo)
研究方向和文章舉例
“從癌前病變發(fā)展到晚期疾病的動(dòng)態(tài)的細(xì)胞、形態(tài)和分子特征?！?/p>
“腫瘤的轉(zhuǎn)移播散、復(fù)發(fā)機(jī)制探索”
“免疫、基質(zhì)等細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用”
