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大家好呀！今天給大家介紹一篇發表在Clinical Cancer Research（IF:12.531）上的文章。PD-1免疫治療聯合白蛋白紫杉醇可用于治療轉移性三陰性乳腺癌（TNBC）。已有研究表明與單一化療方法相比，化療聯合免疫治療的效果更好。本研究作者分析83例乳腺癌在接受新輔助化療前后的免疫相關基因的表達水平。研究TIME基因表達水平與RFS和OS的相關性。此外，作者使用scRNA-seq分析研究NAC的系統影響特征。結果表明，在非TNBC中，基因的表達水平與RFS和OS無關，而在TNBC中多個免疫相關基因與長期預后有關。乳腺癌患者的外周血中存在高細胞毒性T細胞特征與疾病復發和發展有關。本研究作者全面描述了NAC對TIME的影響，鑒定到TNBC對NAC的免疫作用十分敏感。免疫相關基因的表達水平增加與預后較好有關。外周血中細胞毒性基因的表達可能是疾病復發的一類生物標志物。

Changes in Peripheral and Local Tumor Immunity after Neoadjuvant Chemotherapy Reshape Clinical Outcomes in Patients with Breast Cancer

乳腺癌患者輔助化療后周圍和局部腫瘤免疫狀態和臨床結局重塑

結果：

1.RD中的sTILs可以改善對NAC不完全應答的TNBC患者的預后

本研究包括83例乳腺癌患者（44例TNBC），患者的相關信息如表1所示。由于sTILs可以作為乳腺癌患者的預后因子，作者首先進行KM分析。在接受NAC治療后的TNBC患者中sTILs豐度較高的患者RFS和OS較好（圖1A）。

2.NAC對TNBC患者免疫相關基因表達水平的抑制作用

作者對接受NAC后的患者的770個免疫相關基因的表達水平進行分析。基于這些基因的表達水平進行聚類，可分為不同的簇。其中大部分luminal/hormone 受體亞型的腫瘤為簇1，大部分HER2+亞型為簇2，大部分basal-like/TNBC亞型為簇3（圖1B）。接受NAC前后免疫相關基因表達水平的差值如圖1C所示，大部分TNBC患者中免疫基因的表達水平在接受NAC后降低。

3.NAC誘導的免疫相關基因表達使TNBC預后的預測因子

盡管sTIL中TIME的變化不能作為TNBC的預后因子，作者研究免疫相關基因是否與患者的結局有關。作者對接受NAC前后基因表達水平差異進行迭代Cox比例風險模型分析。有11個基因的上調表達與RFS較好有關，而有1個基因的上調表達與RFS較差有關。有大部分基因的上調與OS較好或OS較差有關（圖2A）。KM分析表明，CDH1與RFS負相關而CD70與RFS正相關（圖2B）。然而，在非TNBC患者中免疫相關基因的表達水平與RFS和OS沒有相關性。

將這些基因表達水平分解為生物信息學分類的免疫標記。與RFS和OS較好的基因集如圖3A所示，大部分與T細胞極化，T細胞免疫和T細胞激活有關。KM分析表明T細胞激活和NK細胞功能上調與RFS較好有關（圖3B）。然而，非TNBC患者中沒有基因集與RFS和OS有關。這些結果表明，NAC可以促進TNBC患者的免疫活性并改善患者的預后。

4.NAC誘導腫瘤和外周血T細胞克隆型和功能改變

作者對8個TNBC和7個非TNBC樣本進行TCRβ鏈測序評估T細胞克隆的數量及接受NAC前后TIME中T細胞克隆的情況。結果表明，T細胞數量與sTIL相關性較強，而NAC沒有改變T細胞克隆型。將乳腺癌按照亞型劃分，NAC的克隆型也沒有顯著差異。TNBC在接受NAC后T細胞克隆型下降，非TNBC在接受NAC后T細胞克隆型升高。為進一步研究免疫治療過程中T細胞克隆型和功能的變化，作者收集了4個乳腺癌患者的PBMCs（圖4A）。在接受NAC的TNBC患者中poly-functional的PD-1^HI CD8⁺ T細胞的比例增加（圖4B），而ER⁺患者的PD-1^HI CD8⁺細胞比例降低（圖4B）。HR⁺HER2⁺的患者在接受NAC后T細胞功能幾乎完全喪失。TNBC患者中PD-1^HI CD8⁺細胞產生的細胞因子主要為效應因子和趨化細胞因子（圖4C）。使用TCR測序分析接受NAC前后的PD-1^HI CD8⁺和PD-1^NEG CD8⁺ T細胞。盡管所有樣本中T細胞數量一致，但是在PD-1^HI CD8⁺ T細胞中的克隆型比例較低（圖4D）。這表明PD-1 ^HI中的重復序列較多，為克隆擴增。與PD-1 ^NEG CD8⁺ T相比PD-1 ^HI中發生克隆型擴增的比例較高（圖4E）。

5.外周血PD-1HI CD8+ T細胞的scRNA-seq分析鑒定獨特的細胞溶解效應細胞

接下來，作者對2例接受NAC后的TNBC患者手術室的外周血PD-1^HI CD8⁺ T細胞進行scRNAseq，1例患者為Pt.1另一例患者為Pt.4。UMAP將細胞分為5個cluster（圖5A和5B）。圖5C為每個cluster排名前10的差異表達基因。盡管細胞組成比較類似，但是cluster0富集于Pt.4中。cluster0中的大量的MHC-I，MHC-II家族成員，細胞溶解因子和免疫檢查點基因高表達（圖5C和5D）。分析關鍵細胞溶解因子和殺傷鑒定基因的表達模式表明這些基因幾乎僅在cluster0中表達。為了深入了解cluster0中的基因，作者對2例接受NAC后的TNBC患者的PBMCs進行scRNA-seq（Pt.4和Pt.5）。使用UMAP降維和SingleR進行細胞類型注釋（圖5E）。有7個基因富集于cluster0中（PDCD1,NKG7,LAG3,GZMH,GZMB,GNLY,FGFBP2），有1個基因富集與PT.4（HLA-G），對這8個基因進行進一步分析。這8個基因在CD8⁺ T細胞中的表達水平最高（圖5F）。

6.血液中存在細胞溶解基因特征且與復發率增加有關

為研究cluster0代表基因細胞溶解特征是否與疾病結果有關，作者對58例患者的全血進行分析，其中包括34例接受NAC的患者和24例未進行治療的患者樣本（表2）。選擇cluster0中富集的8個基因，Pt.4中富集的1個基因和3個標準化對照基因進行NanoString基因表達分析。有幾個基因在早期疾病復發的RD患者和接受NAC后的pCR患者中的表達水平具有顯著差異（圖6A）。PDCA1+NKG7+LAG3+GZMH+GZMB+GNLY+FGFBP2-HLA-G的綜合打分同樣與疾病的進展顯著相關（圖6B）。然而這些基因的表達模式具有一定異質性和獨立性（圖6C）。

結果：

本研究作者對83例乳腺癌患者的TIME進行分析，研究接受NAC的TNBC患者腫瘤免疫相關基因與預后和治療結果的相關性。在免疫相關基因中細胞毒性效應細胞相關基因與治療結果顯著相關。此外，作者鑒定到接受NAC的TNBC患者的外周血中PD-1^HI CD8⁺ T細胞的細胞溶解因子顯著增加。TCR克隆型分析表明化療可能會增加腫瘤中T細胞克隆。對手術后的TNBC患者的外周血進行單細胞測序鑒定到細胞溶解效應T細胞及其高表達基因。然而，本研究還存在一定局限性，例如本研究的scRNAseq的樣本量較小。本研究為更好的理解化療改變TIME和抗腫瘤免疫提供了新的信息，可以更好的了解可能受益于化療的患者。