掃碼聯(lián)系客服
A Comprehensive Bioinformatics Analysis of Notch Pathways in Bladder Cancer
膀胱癌Notch通路的生物信息學(xué)分析
今天分享一篇，在2021年5月份發(fā)表在cancers (IF: 6.999）上關(guān)于利用公共表達(dá)數(shù)據(jù)探究Notch通路在膀胱癌的作用的文章。
Simple Summary
Notch通路在胚胎學(xué)和許多腫瘤疾病中具有重要意義。然而，其在膀胱癌(BCa)中的作用迄今尚未得到深入研究。通過(guò)生物信息學(xué)分析現(xiàn)有的膀胱癌表達(dá)數(shù)據(jù)，有助于探索Notch通路對(duì)膀胱癌的影響。利用這些信息可以探究膀胱癌發(fā)生的原因，同時(shí)找到用于預(yù)測(cè)疾病預(yù)后情況的生物標(biāo)志物。分析證實(shí)，Notch受體NOTCH2/3和其配體DLL4 能夠直接作用于基本的細(xì)胞功能同時(shí)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，因此可以作為膀胱癌的潛在驅(qū)動(dòng)因子。
背景：Notch信號(hào)通路的一個(gè)特征是其在腫瘤生物中的可變性，例如從抑癌作用到致癌作用。目前，Notch信號(hào)通路在膀胱癌中的作用尚不清楚。
方法：從GTEx and TCGA-BLCA這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取數(shù)據(jù)，根據(jù)Notch受體、配體和下游基因的RNA表達(dá)水平，探討經(jīng)典Notch通路在BCa中的作用。對(duì)于癌癥和非癌癥樣本的統(tǒng)計(jì)分析，我們使用R軟件包和公共數(shù)據(jù)庫(kù)/網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器。
結(jié)果：所有 Notch受體（NOTCH1，2，3，4），delta類Notch配體（DLL1，3，4），以及經(jīng)典的下游調(diào)節(jié)基因hairy 和 enhancer of split 1 (HES1)，在對(duì)照組和膀胱癌中的表達(dá)情況均有差異。NOTCH2/3受體的高表達(dá)水平與較差的總生存率（OS）和較短的無(wú)病生存率（DFS）相關(guān)。然而，在長(zhǎng)期（>8年）隨訪中，NOTCH2表達(dá)與更好的總生存率（OS）和無(wú)病生存率（DFS）相關(guān)。此外，DLL4表達(dá)高的病例與差的總生存率（OS）相關(guān)但與無(wú)病生存率（DFS）的提高有關(guān)。通路網(wǎng)絡(luò)分析顯示，NOTCH2/3與細(xì)胞周期、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、淋巴細(xì)胞亞型數(shù)量以及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。
結(jié)論：NOTCH2/3和DLL4是BCa中Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在驅(qū)動(dòng)因素，提示Notch及其相關(guān)通路通過(guò)直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞或與細(xì)胞周期和EMT相互作用在BCa的進(jìn)展和預(yù)后中起重要作用。
關(guān)鍵詞：Notch通路；生物信息學(xué)分析；膀胱癌；預(yù)后；免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)
Introduction
Notch信號(hào)通路是一種高度保守的配體-受體信號(hào)通路，參與腫瘤生物學(xué)的各個(gè)方面，在腫瘤干細(xì)胞、血管生成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤免疫和耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，Notch通路在膀胱癌(BCa)的進(jìn)展和預(yù)后中受到了重視。然而，文獻(xiàn)結(jié)果卻有很大的不同。Hayashi等人認(rèn)為NOTCH2是致癌基因，其高表達(dá)和拷貝數(shù)增多會(huì)促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展。相反，Greife等人發(fā)現(xiàn)NOTCH2在一組侵襲性膀胱癌的樣本中其mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。總的來(lái)說(shuō)，文獻(xiàn)報(bào)道的資料中對(duì)Notch信號(hào)通路在膀胱癌的作用有明顯的偏差，可能是抑制作用或促進(jìn)作用。因此，Notch信號(hào)通路膀胱癌的作用機(jī)制尚不清楚。
腫瘤是惡性細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境(TME)共同進(jìn)化的結(jié)果，腫瘤的進(jìn)展、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲和耐藥是由TME和癌細(xì)胞之間的雙向相互作用調(diào)節(jié)的。免疫浸潤(rùn)是TME的重要組成部分，在膀胱癌的進(jìn)展中起著重要作用。因此，了解調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的基因?qū)τ诹私飧嚓P(guān)于癌細(xì)胞如何逃避或如何抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)至關(guān)重要。到目前為止，Notch信號(hào)在腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)用已經(jīng)在各種癌癥中得到了廣泛的報(bào)道。然而，有關(guān)Notch與膀胱癌的免疫應(yīng)答機(jī)制及相互作用的關(guān)系研究卻很少。
各種眾所周知的與癌癥相關(guān)的途徑都參與了癌癥的發(fā)生，例如Wnt、Hedgehog、hypoxia和TGF/BMP通路，它們可能影響Notch信號(hào)。同時(shí)，一些信號(hào)通路，如雷帕霉素（TSC-mTOR）通路在膀胱癌中發(fā)揮重要的作用。
綜上所述，通過(guò)分析膀胱癌 mRNA的表達(dá)水平，Notch信號(hào)中最有趣的角色是(i) Notch受體:NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4;(ii)鋸齒狀、典型Notch配體Jagged 1 (JAG1)和Jagged 1 (JAG2)，以及delta狀典型Notch配體1 (DLL1)、DLL3、DLL4;(iii)典型下游基因:hairy and enhancer of split 1 (HES1)和hairy/enhancer of split-related with YRPW motif protein 1 (HEY1)。本研究通過(guò)全面的生物信息學(xué)分析，試圖闡明膀胱癌中Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制和生物學(xué)過(guò)程，包括其對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答的可能影響以及與已知癌癥相關(guān)通路的關(guān)系（圖1）。
圖 1
2.1 數(shù)據(jù)采集
從GTEx下載正常膀胱標(biāo)本的靶基因表達(dá)數(shù)據(jù)，非癌癥樣本和膀胱癌樣本的臨床數(shù)據(jù)集以及靶基因表達(dá)（TCGA-BLCA）從TCGA下載。HTseq-count文件用于列出每個(gè)基因的唯一映射讀取數(shù)。“DESeq2”R包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，并對(duì)樣本之間的基因表達(dá)進(jìn)行批量校正，以使特征具有可比性。
2.2 不同亞組的表達(dá)水平分析
TCGA和GTEX數(shù)據(jù)集中沒(méi)有細(xì)胞類型特異性表達(dá)水平; 然而，我們可以從腫瘤組織中提取基因表達(dá)譜，通過(guò)基因集變異分析(GSVA)來(lái)推斷腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILS)的相對(duì)豐度，從而進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞型分析。
利用以下分組進(jìn)行分析：（i） 原發(fā)腫瘤，非癌標(biāo)本(ii）腫瘤分期：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期(iii)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:N0(無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、N1(1 ~ 3個(gè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、N2(4 ~ 9個(gè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、N3(10個(gè)以上腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移) (iv)組織學(xué)狀態(tài):乳頭狀腫瘤(PT)、非乳頭狀腫瘤(NPT) ;(v)種族:亞洲人、黑人或非裔美國(guó)人、白種人;性別:女性vs.男性患者;(vii)分子亞型:神經(jīng)元型(NET)、基底型(BT)、基底鱗狀型(BST)、管腔型(LT)、管腔浸潤(rùn)型(LIT)、管腔乳頭型(LPT) ;(viii)突變TP53, TP53非突變。我們使用R studio統(tǒng)計(jì)軟件，包括“Bioconductor”、“tidyr”、“complexHeatmap”、“RColorBrewer”、“Biocmanager”、“circlize”和“ggplot2”軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和結(jié)果可視化。UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu作為輔助分析工具，根據(jù)分子亞型和TP53突變狀態(tài)，分析不同亞組靶基因的表達(dá)水平。排除樣本量<7的亞組；設(shè)置p值<0.05（具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。
2.3. 相關(guān)性分析及診斷價(jià)值評(píng)價(jià)
對(duì)于相關(guān)分析和相關(guān)矩陣可視化，我們使用統(tǒng)計(jì)軟件R studio和R包“performanceAnalytics”、“Hmisc”、“pROC”和“corrplot”。 我們分析了不同靶基因之間的相關(guān)性。另外，根據(jù)腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（TISIDB；http://cis.hku.hk/TISIDB），分析了Notch成員（Notch受體和Notch配體）與淋巴細(xì)胞的相關(guān)性以及與BCa中免疫調(diào)節(jié)劑的關(guān)系。相關(guān)系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)定義如下：0.00–0.19（非常弱）、0.20–0.39（弱）、0.40–0.59（中等）、0.60–0.79（強(qiáng)）和0.80–1.0（非常強(qiáng)）。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們使用（ROC）曲線來(lái)評(píng)估相關(guān)基因的診斷價(jià)值。此外，為了確定Notch信號(hào)的關(guān)鍵因素，我們采用了正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA；多元統(tǒng)計(jì)分析的R包“ropls”）。
2.4. 總生存率（OS）和無(wú)病生存率（DFS）分析
臨床數(shù)據(jù)從TCGA-BLCA下載并使用R studio（軟件包：“ComplexHeatmap”、“clusterProfiler”、“survival”、“survMisc”、“survminer”、“RColorBrewer”）進(jìn)行分析。對(duì)OS和DFS進(jìn)行Kaplan-Meier估計(jì)以評(píng)估靶基因的預(yù)后價(jià)值。我們使用Cox回歸來(lái)尋找獨(dú)立因素，landmark分析和時(shí)間依賴性協(xié)變量來(lái)評(píng)估組間交叉的預(yù)后價(jià)值。我們還用了GSCALite (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/），一個(gè)用于基因集癌癥分析的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，估計(jì)Notch成員基因的DNA甲基化對(duì)總生存率有影響。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集中沒(méi)有關(guān)于癌癥特異性生存率的數(shù)據(jù)。
2.5. 基因-基因相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析和基因集富集分析（GSEA）
我們用GeneMANIA (http://genemania.org/co-expression)構(gòu)建基因-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)（GGI）, GSEA軟件用于膀胱癌和非癌樣本的功能分析。 此外，通過(guò)使用GSCALite(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/），評(píng)估靶基因與其他眾所周知的膀胱癌相關(guān)途徑之間的關(guān)系。
2.6.目的基因身體展示圖以及腫瘤分析
利用基因表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫(kù)（GEPIA, http://gepia.cancer-pku.cn;），對(duì)各種癌癥和正常組織的Notch相關(guān)基因表達(dá)水平在身體圖上進(jìn)行展示。此外，我們還使用了Oncomine(https://www.oncomine.org)，用于對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行元分析。膀胱癌和對(duì)照組織中靶基因編碼的蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)（IHC）染色來(lái)自人類蛋白質(zhì)圖譜(HPA, http://www.proteinatlas.org/)。p值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.7. 其他統(tǒng)計(jì)分析
所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。單因素分析采用方差分析、t檢驗(yàn)、Wilcoxon檢驗(yàn)、Tukey的HSD和排列檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson檢驗(yàn)或Spearman分析。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型進(jìn)行多變量分析。
從TCGA-BLCA中獲得46例腫瘤標(biāo)本（n=406）和19例非癌標(biāo)本，從GTEx中提取21例正常膀胱標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)通過(guò)質(zhì)控，保證了表達(dá)水平的差異性。
3.1. 基因表達(dá)分析
3.1.1. Notch通路相關(guān)基因在膀胱癌及對(duì)照組中的表達(dá)
與對(duì)照組相比，膀胱癌樣本中NOTCH1、NOTCH2、NOTCH4、DLL1和DLL4的表達(dá)水平顯著下調(diào)。相反，NOTCH3、DLL3和HES1顯著過(guò)表達(dá)。在對(duì)照組中，TCGA-BLCA非癌樣本中的NOTCH4和DLL4顯著低于GTEx正常組織中的NOTCH4和DLL4。JAG1、JAG2和HEY1沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖2）。
圖 2
3.1.2. 腫瘤不同階段的基因表達(dá)
在腫瘤I期，只有兩個(gè)樣本可用。因此，我們?cè)诓煌[瘤分期的分析中省略了Ⅰ期。NOTCH2在Ⅱ期（S2）的表達(dá)低于Ⅲ期（S3）和Ⅳ期（S4）；S2組JAG2高于S4組。
3.1.3. 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分層患者的基因表達(dá)
與對(duì)照組相比，我們發(fā)現(xiàn)NOTCH2在N0、N1和N2中顯著下調(diào)。NOTCH3和HES1在N0、N1和N2中顯著上調(diào)。NOTCH4、DLL1和DLL3在N0、N1、N2和N3范圍內(nèi)顯著改變。此外，N1、N2和N3之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異，并且HEY1在亞組之間也未發(fā)生顯著變化。NOTCH基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)關(guān)。
3.1.4. 乳頭狀和非乳頭狀腫瘤的基因表達(dá)
與對(duì)照樣品相比，乳頭狀腫瘤和非乳頭狀腫瘤中的NOTCH3、DLL3和HES1顯著增加，而乳頭狀腫瘤和非乳頭狀腫瘤中的NOTCH1、NOTCH2、NOTCH4和DLL1顯著減少。
對(duì)乳頭狀和非乳頭狀膀胱癌的分析顯示，與非乳頭狀相比，乳頭狀中NOTCH2、JAG1、DLL1和DLL3的表達(dá)水平較低，而PT中NOTCH4、DLL4和HES1的表達(dá)水平上調(diào)。
3.1.5. 按種族和性別分層患者的基因表達(dá)
發(fā)現(xiàn)NOTCH2和DLL4在亞洲人（ASI，n=43）、白種人（CAU，n=323）和黑人或非洲裔美國(guó)人（AFA，n=23）之間的表達(dá)存在顯著差異。與白種人相比，黑人或非洲裔美國(guó)人中NOTCH1、JAG1和JAG2顯著上調(diào)，而與黑人或非洲裔美國(guó)人相比，亞洲人中NOTCH4顯著上調(diào)。其中NOTCH3、DLL1、DLL3和HEY1的表達(dá)水平無(wú)顯著差異。
隊(duì)列包括299名男性和107名女性患者（性別比為3:1）。對(duì)照組中性別比為2:1（男性n=14，女性n=5）。只有JAG2和DLL3在女性患者中表現(xiàn)出性別特異性差異表達(dá)，并且表達(dá)水平較高。
3.1.6. 分子亞型的基因表達(dá)
我們研究了神經(jīng)細(xì)胞（NET）、基底細(xì)胞（BT）、基底鱗狀細(xì)胞（BST）、管腔（LT）、管腔浸潤(rùn)（LIT）和管腔乳頭狀細(xì)胞（LPT）的基因表達(dá)。與來(lái)自TCGA-BLCA數(shù)據(jù)集的非癌組織對(duì)照組（C-TCGA）相比，NOTCH1僅在LT中下調(diào)；NOTCH2在LT、LIT和LPT中下調(diào)；NOTCH4在BST中下調(diào)，而NOTCH3在LT、LIT、LPT和BST中上調(diào)。
3.1.7. 腫瘤抑制因子TP53突變分層患者的基因表達(dá)
根據(jù)TP53突變情況，將膀胱癌標(biāo)本分為有突變（TP53M）和無(wú)突變（TP53WT）。與C-TCGA相比，TP53突變患者的NOTCH1、NOTCH2和NOTCH4表達(dá)下調(diào)，而NOTCH3表達(dá)上調(diào)。無(wú)突變的患者僅NOTCH2表達(dá)下調(diào)，NOTCH4表達(dá)上調(diào)。比較BCa組織中TP53的突變狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，TP53WT中NOTCH1和NOTCH4的表達(dá)較高，而NOTCH2的表達(dá)較低。
3.2. Notch相關(guān)基因的相關(guān)性和診斷價(jià)值，以及Notch通路、淋巴細(xì)胞亞型和免疫調(diào)節(jié)劑之間的相關(guān)性
3.2.1. 膀胱癌隊(duì)列中Notch相關(guān)基因的相關(guān)性研究
相關(guān)分析顯示NOTCH4與DLL4呈強(qiáng)正相關(guān)（r=0.81，p值<0.001），NOTCH1與JAG1呈中度正相關(guān)（r=0.59，p值<0.001），NOTCH3與JAG1呈中度正相關(guān)（r=0.43，p值<0.001），JAG2與DLL1呈中度正相關(guān)（圖3）。
圖 3
（A）膀胱癌靶基因間的相關(guān)性（n=406）：直方圖說(shuō)明：（i）各分量的核密度估計(jì)和分布的直方圖顯示在對(duì)角線上；（ii）在對(duì)角線底部：顯示帶有擬合線的雙變量散點(diǎn)圖；（iii）在對(duì)角線的頂部：相關(guān)值加上星星的顯著性水平；每個(gè)顯著性水平與一個(gè)符號(hào)相關(guān)：p值0.001、0.01、0.05分別與符號(hào)、***、***、*相關(guān)；圖表中的數(shù)字是皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r），正標(biāo)記為紅色，負(fù)標(biāo)記為綠色；（iv）圖表兩側(cè)的數(shù)字表示表達(dá)式值的范圍= Log2(read count value)。N1: NOTCH1, N2: NOTCH2, N3: NOTCH3, N4: NOTCH4, D1: DLL1, D3: DLL3, D4: DLL4, J1: JAG1, J2: JAG2, HS1: HES1, HY1: HEY1. （B）OPLS-DA結(jié)果。OPLS-DA-based分離膀胱癌和對(duì)照組。（B2）OPLS-DA各功能的可變投射重要性-VIP(variable importance in projection)。（C） 代表性ROC曲線顯示膀胱癌檢測(cè)在NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL3、DLL4和HES1基礎(chǔ)上的診斷準(zhǔn)確率（AUC），C中標(biāo)記的紅十字是最佳閾值位置/值。
3.2.2. Notch相關(guān)基因的潛在診斷價(jià)值
如圖3B1所示，大多數(shù)膀胱癌病例（n=406）可通過(guò)OPLS-DA評(píng)分圖與對(duì)照組（n=40）進(jìn)行區(qū)分。OPLS-DA中的可變投射重要性（variable importance in projection:VIP）確定了8個(gè)潛在的關(guān)鍵基因，按降序排列：DLL3、NOTCH4、NOTCH2、HES1、DLL1、NOTCH1、DLL4和NOTCH3（圖3B2）。
3.2.3. Notch通路與淋巴細(xì)胞亞型及免疫調(diào)節(jié)基因的關(guān)系
對(duì)膀胱癌中Notch受體和配體與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平和相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)分析。對(duì)膀胱癌中Notch受體和配體與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平和相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)分析。NOTCH2與淋巴細(xì)胞的相關(guān)性最強(qiáng)，大多為陽(yáng)性。相反，NOTCH3與大多數(shù)淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（圖4A）。
圖 4
免疫調(diào)節(jié)劑可分為免疫抑制劑和免疫刺激劑。NOTCH2似乎是Notch受體中最關(guān)鍵的成員，與免疫抑制劑呈正相關(guān)， 即，（i）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1（TGFBR1，ρ=0.435，p值<2.2×10）(圖5C1），（ii）程序性細(xì)胞死亡1配體2（pCD1lg2;圖5C2），（iii）巨噬細(xì)胞集落刺激因子I受體前體（CSF1R;圖5C3）和（iv）NOTCH2具有程序性細(xì)胞死亡1配體1（CD274;圖5C4）。相反，NOTCH3與大多數(shù)免疫抑制劑呈顯著負(fù)相關(guān)，盡管相關(guān)系數(shù)相對(duì)較低(圖5A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)NOTCH4和DLL4與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（KDR，ρ=0.762，p值<2.2×10）呈強(qiáng)正相關(guān)（圖5C5；圖5C6）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)NOTCH2與免疫刺激因子之間存在中度相關(guān)性，其中與干擾素基因蛋白刺激因子（圖5C7）和T淋巴細(xì)胞活化抗原CD86（圖5C8）呈正相關(guān)。
圖 5
3.3. 總生存率（OS）和無(wú)病生存率（DFS）分析
3.3.1. 總生存率（OS）對(duì)靶基因表達(dá)水平的依賴性
Kaplan-Meier估計(jì)表明，NOTCH3、JAG1、DLL4和HEY1高表達(dá)與OS降低顯著相關(guān)。相反，HES1的高表達(dá)與延長(zhǎng)生存期相關(guān)（圖6）。
圖 6
3.3.2. 無(wú)病生存率對(duì)靶基因表達(dá)水平的依賴性
Kaplan-Meier對(duì)DFS結(jié)果的估計(jì)顯示，NOTCH3、JAG1、JAG2和HEY1高表達(dá)患者的DFS比低表達(dá)的患者短。相反，DLL4和HES1高表達(dá)與更好的DFS相關(guān)（圖7）。
圖 7
3.3.3. 獨(dú)立因子的組合與OS和DFS相關(guān)，而與Notch因子的甲基化則不相關(guān)
Notch配體結(jié)合導(dǎo)致Notch受體的蛋白水解和不同靶程序激活，從而導(dǎo)致不同的細(xì)胞命運(yùn)。因此，某些Notch受體和特定配體的結(jié)合可能是最相關(guān)的，因此，我們基于COX回歸結(jié)果和線性擬合模型（風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=系數(shù)1*基因表達(dá)1+…+系數(shù)N*基因表達(dá)N）分析了Notch成員的幾種組合與OS和DFS的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)顯著延長(zhǎng)的OS與四種組合的低值相關(guān)：（i）NOTCH3+JAG1(cut-off = 23.7, p-value = 0.047)，（ii）NOTCH3+DLL4(cut-off = 15.7, p-value = 0.036)，（iii）NOTCH3+JAG1+HES1(cut-off = 15.6, p-value = 0.024)，（iv）NOTCH3+DLL4+HES1(cut-off = 4.1, p-value = 0.015)。
然而，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因的甲基化狀態(tài)對(duì)OS或DFS有顯著影響。
3.4. 基因網(wǎng)絡(luò)與基因集富集分析（GSEA）
3.4.1. 基因網(wǎng)絡(luò)分析
我們用GeneMANIA (http://genemania.org/，于2020年11月12日訪問(wèn)），以構(gòu)建基因-基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。除了Notch因子外，該網(wǎng)絡(luò)還包括另外20個(gè)可能頻繁相互作用的基因，發(fā)現(xiàn)了435個(gè)鏈接（相互作用）（圖8A）。這些聯(lián)系包括基于基因鄰域、基因共現(xiàn)、相似酶功能、相同途徑和其他因素的共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（45.98%）、物理相互作用（25.26%）、途徑相互作用（13.01%）、遺傳相互作用（5.76%）和預(yù)測(cè)相互作用（4.95%）、共表達(dá)（4.81%）和共定位（0.23%）。
該網(wǎng)絡(luò)的功能分析描述了基因在notch相關(guān)通路中的作用及其功能。在圖8A中，我們將四個(gè)主要功能表示為彩色的圓形部分。總的來(lái)說(shuō)，我們發(fā)現(xiàn)了23個(gè)與Notch信號(hào)通路直接相關(guān)的基因(藍(lán)色):其中11個(gè)(NOTCH1-4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、APH1A、APH1B、NCSTN)參與Notch受體加工(橙色)，5個(gè)(DTX1、DLL3、DLL1、JAG1、JAG2)參與Notch結(jié)合(紅色)，4個(gè)(DTX1、LENG、NEURL1、HEY1)參與Notch信號(hào)通路調(diào)控(粉色)。功能部分重疊(圖8A)。
此外，研究結(jié)果還揭示了與干細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定和免疫系統(tǒng)發(fā)育等其他功能的一些重要而有趣的相互作用。
3.4.2. 基因集富集分析（GSEA）
在GSEA中，典型路徑分析是基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)通過(guò)NES對(duì)基因集進(jìn)行排序時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞周期”是最顯著的術(shù)語(yǔ)（NES=2.04，p<0.001）（圖8B）。根據(jù)NES的排序，基于Reactome pathway Knowledgebase[67]的經(jīng)典路徑分析顯示與增殖、p53和DNA修復(fù)反應(yīng)的基因顯著富集，例如，“DNA損傷端粒應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老”（NES=2.22，p<0.0001）（圖8C）。GSEA中基因本體論的生物過(guò)程本體論分析子集（GO分析的BP子集）也顯示了參與增殖的基因集富集：“GO有絲分裂細(xì)胞周期檢查點(diǎn)”（NES=2.21，p<0.0001）（圖8D）。
此外，GSEA揭示了與樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、CD4 T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞相關(guān)的免疫特征基因集，例如“GSE20727 CTRL與ROS INH和DNFB過(guò)敏原治療的DC DN的比較”（NES=2.26，p<0.0001；圖8E）。
3.4.3. Notch通路與其他已知癌癥相關(guān)通路的相互作用
利用GSEA，我們?cè)u(píng)估了靶基因與其他已知的癌癥相關(guān)途徑之間的關(guān)系。此外，我們還計(jì)算了Notch通路被Notch基因激活或抑制的膀胱癌病例的百分比。分析顯示Notch通路在細(xì)胞周期和EMT中起著關(guān)鍵作用，NOTCH4、NOTCH2、NOTCH3、JAG1、DLL1和DLL4的高陽(yáng)性（激活）或陰性（抑制）值表明了這一點(diǎn)（圖8F）。
圖 8
3.5. Notch相關(guān)基因和體圖的腫瘤學(xué)分析
3.5.1. 膀胱癌中Notch因子的Meta分析
我們根據(jù)浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌和非癌組織之間的表達(dá)水平進(jìn)行了腫瘤胺meta分析(https://www.oncomine.org/)。meta分析顯示，在以前的研究中，BCa中NOTCH3和HES1也顯著上調(diào)（圖9A，C），而DLL4的表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變，在之前也沒(méi)有得到廣泛評(píng)估（圖9B）。有趣的是，與本研究相反，在Dyrskjot的研究中，NOTCH1、NOTCH2和JAG1在膀胱癌中顯著過(guò)表達(dá)，而其他被檢測(cè)的基因沒(méi)有顯示出任何顯著差異。
圖 9
3.5.2. 正常和膀胱癌患者Notch因子體圖的研究
為了觀察正常人和膀胱癌患者中靶基因的分布和表達(dá)情況，我們從基因表達(dá)譜交互分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建了靶基因的表達(dá)體圖譜（(http://gepia.cancer-pku.cn）。圖9描述了NOTCH3、DLL4和HES1作為Notch通路的代表基因。NOTCH3和HES基因的表達(dá)在BCa中分別上調(diào)2.47倍和1.48倍（圖9A1、A2、C1、C2），而DLL4在膀胱癌中下調(diào)0.66倍（圖9B1、B2）。
3.5.3. 正常膀胱組織和BCa組織中Notch相關(guān)蛋白的IHC研究
人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）的免疫組化（IHC）蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)（https://www.proteinatlas.org/）證實(shí)了膀胱癌中NOTCH3（圖9A3，A4）和DLL4蛋白（圖9B3，B4）表達(dá)具有差異。
總結(jié)：
結(jié)果表明，NOTCH2、NOTCH3和DLL4是膀胱癌中Notch信號(hào)的潛在驅(qū)動(dòng)因素，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和干細(xì)胞，以及與已知的腫瘤相關(guān)途徑如p53、TSC/mTOR、RAS/MAPK和PI3K/AKT直接或間接相互作用，在膀胱癌進(jìn)展和發(fā)展中起著最關(guān)鍵的作用。
