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大家好呀！今天給大家介紹一篇2021年3月發表在Nature Communcation（IF:14.919）上的文章。CD8+ T細胞可以驅動人類惡性腫瘤的適應性免疫反應，這些細胞被腫瘤抗原激活，進行擴張并定位和殺死癌細胞。免疫檢查點抑制劑（ICI）僅對一部分患者有效其治療耐藥性的機制尚不清楚。本研究作者使用單細胞轉錄組和流式細胞技術識別對抗PD-1治療有反應的轉移性黑色素瘤患者的粘膜相關恒定T細胞（MAIT）。MAIT細胞可以作為治療應答性患者的生物標志物并使患者從免疫治療中獲得最大效果。
Circulating mucosal-associated invariant T cells identify patients responding to anti-PD-1 therapy
循環粘膜相關恒定T細胞識別抗PD-1治療的患者
摘要：
免疫檢查點抑制劑可以用于治療轉移性黑色素瘤患者，由于治療反應的不確定性，目前需要一些標志物來確定哪些患者可以受益于免疫檢查點抑制治療。本研究作者結合單細胞轉錄組測序和流式細胞術評估28例抗PD-1治療的轉移性黑色素瘤患者的循環CD8+ T細胞的變化。在免疫治療反應患者中活化和增殖CD8+ T細胞和粘膜相關恒定T細胞（MAIT）的比例高于治療前和整個治療期間。應答患者的MAIT細胞中CXCR4的水平更高，顆粒酶B更多。最后，MAIT比例高于1.7%的患者免疫治療反應更好。作者的結果表明MAIT細胞可以作為抗PD-1治療反應的標志物。
結果：
1.應答患者中激活效應記憶CD8+ T細胞比例較高
首先，作者使用流式細胞技術研究PD-1治療的黑色素瘤患者的T細胞特點，通過聚類分析鑒定到CD8+ T細胞的28個簇。其中C21,C22和C26為T細胞特有的表性特征，CD45RA,CCR,CD27和CD28表達較高而CD25和ICOS表達較低（圖1A）。根據CD38和ICOS的表達確定C28為活化T細胞，根據CD95的表達確定C10為T干細胞記憶細胞，其表型與初始T細胞類似。根據CD28,CD27,BTLA,CD194,CD25,CD95和ICOS的表達確定C1,C20和C27位CCR7+CD45RA-記憶T細胞。根據CD39的表達確定C20為TCM細胞。C6,C17,C11,C2,C24和C5為末期分化T細胞。根據CD45RA,CCR7,CD25和CD95的表達確定C15,C4,C25,C14,C9,C13,C12,C19和C16為效應記憶T細胞。其中，C14中PD-1和CD57的表達水平中等，表明C14為可復制性衰老細胞。C12中CD28和CD27的表達水平中等，表明C12位過度效應記憶T細胞。根據CXCR16的表達確定C9位具有遷移能力的效應記憶細胞。根據ICOS，CD95，HLA-DR和CD38等的表達確定C16是活化增殖效應記憶T細胞。在應答患者中C16富集程度更高（圖1B），在開始治療前應答患者中C16，高增殖Ki67+CD71+效應細胞比例較高，且在治療后也相對穩定（圖1B）。
圖1 CD8+ T細胞單細胞分析鑒定應答患者中活化效應記憶T細胞比例較高
2.scRNA-seq表明在應答患者中MAIT豐度更高
作者分離接受抗PD-1治療后的20例患者的T0,T1和T2期的CD3+CD8+ T細胞進行scRNA-seq。質控后得到56142個細胞并去除4210個NK細胞和231個單核細胞，最終獲得51701個CD8+ T細胞。聚類分析鑒定到8個細胞簇（圖2A和2B），根據LEF1,SELL和TCF7表達鑒定初始T細胞，根據GZMB,GNLY,NKG7,EFHD2和CXCR322表達鑒定末端分化效應記憶細胞。作者鑒定到兩種效應記憶細胞，一類是轉移效應記憶細胞另一類是成熟活化細胞。通過HLADRA,HLADRB1,CD74,GZMA,PCNA,MKI67和MCM等的表達鑒定效應記憶T細胞。通過KLRB1,SLC4A10,MAF和CXCR4的表達鑒定粘膜相關恒定T細胞（MAIT）。偽時序分析表明，分化過程從初始T細胞開始，通過激活初始T細胞，過度效應T細胞和效應記憶T細胞向末端分化T細胞分化。在整個過程中，MAIT細胞輸入偽時間軌跡的不同分子。流式細胞技術表明應答組的活化效應記憶T細胞比例較高（圖2C）。應答組的效應記憶T細胞比例較高（圖2C）。在治療前和治療第一個周期后，應答組的MAIT細胞比例較高（圖2D）。總的來說，隨治療時間的增加，MAIT細胞的激活具有動態調節作用。
圖2 MAIT細胞在應答組中豐度較高
3.應答組中活化MAIT細胞豐度更高
作者對治療前和治療后的MAIT細胞進行亞群聚類，進一步了解這些細胞在抗腫瘤免疫反應中的細胞動力學。共鑒定到2類MAIT亞群，其與T細胞激活或效應功能相關的基因DUSP1,ZFP36,TNFAIP3,ZFP36L2,FOS,CXCR4和CD69等表達水平存在差異（圖3A和3B）。在治療前，治療第一個周期和第二個周期后應答組的活化MAIT比例較高（圖3C）。
圖3 活化MAIT細胞在應答組豐度較高
隨后，作者使用流式細胞技術在蛋白水平上進行研究。作者分析MAIT細胞的比例和表型，鑒定到表達TCRα7.2和CD161的CD3+CD8+ T細胞（圖4A），這些細胞在應答患者中存在顯著擴增（圖4A）。此外，作者發現在應答組接受兩輪治療后MAIT細胞比例升高。為確定轉移樣本和為轉移樣本中MAIT細胞的存在，作者分析了一個GEO數據集。該數據集包括患者血液，淋巴結轉移和腫瘤患者的單細胞轉錄組數據。該數據集包括26757個細胞，其中3%的細胞為MAIT細胞（圖4B）。隨后，作者通過使用IL-12,IL-18,CD3/CD8體外刺激MAIT細胞研究MAIT細胞的效應因子功能能力。在應答組和無應答組的MAIT細胞均能產生GRZM-B,IFN-γ和TNF，應答組中MAIT細胞產生IFN-γ和GRZM-B的比例更高（圖4C）。然而在治療前應答組中僅有GRZM-B的比例更高（圖4D）。
圖4 體外刺激MAITC細胞的功能評估
4.治療前根據MAIT細胞識別應答患者
接下來作者評估MAIT細胞水平作為預測抗PD-1治療反應的生物標志物的能力。流式細胞技術分析表明，在CD8+ T細胞中轉移性黑色素瘤患者中MAIT細胞水平中位數為1.7%，根據該中位數對患者進行分層。圖5表明MAIT細胞水平高于1.7%的患者反應更高。
圖5 MAIT細胞水平預測治療反應
結論：
本研究分離接受免疫治療的轉移性黑色素瘤患者的CD8+ T細胞進行單細胞轉錄組測序并分析。結果表明，有反應組和無反應組患者的T細胞亞群組成不同且在治療前兩組患者的T細胞組成不同。這些差異中最相關的是MAIT細胞水平，MAIT細胞是一種初始CD3+ T細胞群并參與對周圍組織感染的早期免疫。作者的研究表明外周血中MAIT細胞比例可以作為免疫治療反應的預測標志物。
參考文獻：
De Biasi, S., Gibellini, L., Lo Tartaro, D. et al. Circulating mucosal-associated invariant T cells identify patients responding to anti-PD-1 therapy. Nat Commun 12, 1669 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21928-4
