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今天和大家分享的是2022年3月1日發表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF：13.751）的一篇文章。看看WGCNA作為一個成熟且好用的算法是如何在干濕結合的工作中發光發熱的吧！
System analysis based on the cancer–immunity cycle identifies ZNF207 as a novel immunotherapy target for hepatocellular carcinoma
基于癌癥-免疫循環的系統分析識別ZNF207為肝細胞癌的新型免疫治療靶點
摘要
免疫檢查點抑制劑作為晚期肝細胞癌 (HCC) 的單一療法未能取得令人滿意的結果，聯合療法卻顯示出更好的效果。識別免疫檢查點抑制劑的新聯合靶點迫在眉睫。作者將癌癥-免疫循環評分與加權基因共表達網絡和系統分析相結合，篩選出HCC中的免疫抑制靶點：鋅指蛋白207（ZNF207）。作者發現缺氧誘導的ZNF207的上調促進了免疫功能正常的小鼠HCC的進展，同時與CD8+T細胞浸潤減少和耗竭增加有關。實驗證明MAPK–CX3CL1軸參與了ZNF207介導的CD8+T細胞趨化。此外，ZNF207轉錄調節吲哚胺2，3-雙加氧酶1，使犬尿氨酸的水平升高。作者還發現ZNF207表達較低的患者對PD1治療更敏感，沉默ZNF207可能有利于抗PD1聯合治療。
背景
肝細胞癌是全球癌癥相關死亡的第三大原因，然而III期臨床試驗中，使用免疫檢查點阻斷劑治療不可切除的肝細胞癌沒有明顯提升患者的生存效益。幾項初步的大型III期試驗使用抗PD1或抗PD-L1藥物聯合抗CTLA4或抗血管生成藥物，這種療法與索拉非尼單藥療法相比，對不可切除的肝細胞癌有更好的生存率。因此，識別新的免疫檢查點和開發新的聯合治療已成為肝細胞癌免疫治療研究的主要焦點。鋅指蛋白207(ZNF207) 是人類基因組中最大的轉錄因子家族，其中ZNF與其他轉錄因子或輔助因子結合在發育、分化和代謝中發揮著不同的作用。在本篇文獻中ZNF207作為與預后不良相關的因子，能夠與抗PD1聯合治療肝細胞癌。
主要研究內容及結論
ZNF207 是 HCC 中潛在的免疫抑制靶點
為了尋找HCC中潛在的免疫抑制靶點，作者使用TCGA中的HCC轉錄組數據，以及從TIP數據庫中下載的癌癥-免疫循環評分進行WGCNA分析。經過聚類分析，作者一共得到20模塊。對所有模塊進行相關性分析，發現存在兩個具有相似內部表達模式的簇（圖1A）。進一步分析發現，簇1 中的模塊與癌癥免疫周期的步驟 1-4 呈正相關，而簇2 中的模塊與步驟 5-7 呈負相關（圖1B）。brown和turquoise是簇1和簇2差異最顯著的模塊，為了進一步探究兩個模塊的功能，作者將兩個模塊的基因進行Gene Ontology 注釋分析。brown模塊中的基因富集在免疫相關信號通路，這些信號通路與癌癥-免疫循環的第 1-4 步呈正相關（圖1C）；turquoise模塊中的基因主要富集在 RNA 轉運、RNA 剪接和紡錘體組裝過程中，這些過程與癌癥-免疫循環的第 5-7 步呈負相關（圖1D）。為了識別 HCC 中的免疫抑制靶點，作者專注于turquoise模塊，最后篩選出符合標準的ZNF207（圖1E）。對22個臨床HCC樣品進行RT-qPCR檢測，發現NF207與CD4、FOXP3、CD11b和CD68之間存在較強的正相關，與CD8A、C2和C3之間卻存在較強的負相關（圖1F-I）。綜上所述，ZNF207 作為 HCC 潛在的免疫抑制靶點，可能與癌癥-免疫循環的步驟相關。
ZNF207在HCC中高表達并與預后不良有關
HCC的進展通常會有基因的異常表達，作者發現腫瘤組織中ZNF207的表達高于正常樣本（圖2A），Oncomine和GEO數據庫的數據也具有同樣的趨勢（圖2B-C）。ZNF207的轉錄和翻譯水平都顯著升高(圖2D-E)。免疫組化(IHC)分析顯示，ZNF207主要在細胞核中過表達，與其作為轉錄因子的作用一致(圖2F)。在 ZNF207高表達組中，HCC患者中stageⅢ和Ⅳ、grade3，4和T3，4所占比例更高，同時與ZNF207低表達組存在顯著差異（圖 2G），并且在多個數據集中表現出更短的總體生存和無病生存（圖2H）。單變量和多變量COX分析顯示ZNF207是獨立的預后因素?？傊?，ZNF207在HCC患者中高表達，并且與更差的預后相關。
在HCC中缺氧會提高ZNF207表達水平
作者發現‘HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP’特征在ZNF207high組中顯著富集（圖3A）。在實驗中，作者觀察到物理和化學模擬缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平（圖3B-C）。BAY87-2243（缺氧誘導因子HIF1α的抑制劑）在缺氧條件下對ZNF207具有更強的抑制作用（圖3D-E）。在常氧條件下，使用質粒過表達HIF1α和HIF2α，發現缺氧對ZNF207的影響可以重現（圖3F-G）。在雙熒光素酶報告基因實驗中，缺氧和氯化鈷的培養都增強了ZNF207啟動子基因的熒光強度（圖3H）。ChIP-qPCR檢測顯示，ZNF207啟動子區域有六個HIF共有結合位點（圖3I）。在常態和缺氧條件下，用抗HIF2α抗體免疫沉淀了位于TSS相對的-1012/-1017 bp的一個DNA序列（圖3J）。總之，缺氧可通過轉錄調控提高HCC中ZNF207的表達。
ZNF207促進與CD8+T細胞浸潤和衰竭有關的HCC
作者首先在體外功能喪失和功能獲得實驗中評估了ZNF207對細胞增殖的影響。無論ZNF207敲低(KD)還是ZNF20過表達（OE），HCC細胞系的細胞增殖都保持不變。此外，ZNF207-KD或ZNF207-OE不會改變免疫缺陷小鼠異種移植腫瘤的生長速度（圖4A-B）。ZNF207-KD或ZNF207-OE處理 Hepa1-6細胞，發現會明顯影響腫瘤的生長速度，但在體外沒有顯示出細胞增殖的差異（圖4C-D）。在ZNF207-KD或ZNF207-OE中，腺相關病毒8顯著改變了免疫功能正常的小鼠的腫瘤生長（圖4E）。這些發現表明ZNF207誘導的HCC進展與腫瘤免疫有關。通過流式細胞術分析，ZNF207-KD增強CD8+ T細胞浸潤并抑制其耗竭（圖4F）。使用條件培養基在體外模擬ZNF207對T細胞功能的影響。從ZNF207-KD Hepa1-6細胞獲得的條件培養基對自然殺傷細胞、B 細胞和巨噬細胞沒有顯著的趨化作用，而對CD8+ T細胞表現出顯著的趨化作用（圖 4G）。ZNF207與TCGA-LIHC數據集中耗盡的T細胞基因特征和免疫檢查點分子呈正相關，與實驗結果一致（圖4J-K）。綜上所述，ZNF207通過腫瘤免疫促進HCC進展，這與CD8+ T細胞的浸潤和耗竭相關。
ZNF207通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+ T細胞浸潤
為了闡明ZNF207影響CD8+ T細胞浸潤和耗竭的潛在機制，對Hepa1-6-shZNF207和Hepa1-6-shNC細胞進行了RNA測序分析。GSEA分析顯示免疫和代謝相關信號通路在ZNF207-KD組中顯著富集（圖5A）。趨化因子、細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路被上調（圖5B）。作者通過細胞因子陣列來比較Hepa1-6-shZNF207和Hepa1-6-shNC細胞的細胞上清液和裂解物中的 111 種細胞因子，CX3CL1與T細胞趨化密切相關，而且在上清液和裂解物中具有一致的趨勢（圖5C），因此作者主要關注CX3CL1。作者通過ELISA證實了細胞上清液中CX3CL1的上調（圖5D）。此外，在人類HCC樣本中觀察到ZNF207和CX3CL1之間存在強負相關（圖5E）。當用CX3CL1中和劑處理時，條件培養基對 CD8+ T 細胞的趨化作用減弱（圖5F）。生存分析顯示，CX3CL1低ZNF207高組的患者總生存率（OS）最差，HR最高，而CX3CL1高ZNF207低組的生存結果最好（圖5G）。以上研究表明，CX3CL1在ZNF207介導的CD8+T細胞浸潤和HCC進展中發揮著重要作用。GSEA分析表明，MAPK信號通路在 ZNF207-KD 組中顯著富集（圖 5A，H）。實驗證明，p38MAPK抑制劑 (SB203580) 可以直接抑制Hepa1-6細胞中的CX3CL1，并且ZNF207-KD對CX3CL1的過表達也可以被SB203580逆轉（圖5I-J）。通過上述的工作，作者發現ZNF207可能通過MAPK-CX3CL1軸抑制CD8+ T細胞浸潤。
ZNF207通過提高犬尿氨酸水平促進CD8+T細胞衰竭
之前的結果顯示除了免疫通路外還在代謝相關通路顯著富集，作者假設ZNF207 可能影響腫瘤代謝以調節CD8+ T細胞功能。通過對Hepa1-6-shZNF207和 Hepa1-6-shNC細胞的代謝組學分析，作者驗證了富集分析的結果；并且ZNF207-KD 后各種代謝物下調，其中氨基酸是差異代謝物的最大成分（圖6A）。KEGG和GO富集分析顯示，差異代謝物在色氨酸代謝通路中顯著富集。ZNF207-KD 后，色氨酸代謝通路中的代謝物水平，包括犬尿氨酸的水平，被顯著抑制（圖6B）。正如預期的那樣，ZNF207-KD 抑制了細胞上清液中的犬尿氨酸水平，ZNF207-OE呈現相反的現象（圖6C）。已有研究表明，腫瘤細胞釋放的犬尿氨酸可誘導 T細胞耗竭，這解釋了ZNF207如何促進HCC中CD8+ T細胞耗竭的部分機制。作者將犬尿氨酸添加到 ZNF207-KD 細胞的條件培養基中以監測 CD8+ T 細胞耗竭，實驗結果顯示犬尿氨酸補充劑顯著誘導 CD8+ T 細胞耗竭（圖6D）。綜上所述，犬尿氨酸參與了ZNF207介導的CD8+ T細胞耗竭。
ZNF207 轉錄調節 IDO1 以促進犬尿氨酸的產生
為了進一步探究ZNF207是如何改變犬尿氨酸代謝，作者關注犬尿氨酸代謝通路中的關鍵基因，這些基因在ZNF207-KD組中顯著下調。ZNF207表達僅提高 IDO1的mRNA水平，但不提高IDO2或TDO2。基于這些發現，作者提出假設：ZNF207可以轉錄調節IDO1。為了驗證假設，作者進行雙熒光素報告基因實驗，結果表明，當IDO1啟動子-熒光素酶質粒與ZNF207-OE質粒共轉染時，熒光強度增加（圖6E）。ChIP-qPCR證實ZNF207可以結合IDO1啟動子的三個區域（圖6F）。用特異性抑制劑PF-06840003抑制IDO1，可逆轉由ZNF207表達介導的犬尿氨酸水平（圖 6G）。此外，PF-06840003治療逆轉了由來自 ZNF207-OE 細胞系的條件培養基引起的CD8+ T 細胞衰竭（圖6H）。體內實驗表明，PF-06840003 治療逆轉了ZNF207-OE的促腫瘤生長作用，IDO1通路在ZNF207介導的 HCC 生長中起關鍵作用。這篇文章初步證明了ZNF207可以通過轉錄調節IDO1來提高犬尿氨酸并誘導CD8+ T細胞衰竭。
ZNF207是與抗PD1療法相結合的潛在治療靶點
通過上述的工作發現，ZNF207可以通過調節腫瘤免疫來促進HCC的進展，在本節工作中將致力于研究ZNF207與抗PD1療法相結合治療HCC患者的潛力。雖然單獨抗PD1治療可以抑制腫瘤生長，但ZNF207-KD聯合PD1單克隆抗體表現出突出的腫瘤抑制效果（圖7A-C）。ZNF207-KD加抗PD1治療組的PCNA陽性細胞百分比最低，而浸潤性T細胞明顯增加（圖7D）。接下來作者采用TIDE和Submap算法來預測TCGA-LIHC數據集中不同ZNF207表達的患者的免疫治療反應率（圖7E）。ZNF207高表達組中只有21.6%的患者對免疫治療有反應，而 ZNF207低表達組有70.3%的患者有反應（圖 7F）。此外，與CTLA-4單克隆抗體相比，ZNF207低表達組患者對PD1單克隆抗體治療的反應更好（圖 7G）。綜上所述，ZNF207可以作為一種生物標志物和治療靶點，結合抗PD1療法治療HCC。
總結
在這個工作中先利用生物信息學方法篩選基因，然后通過生物學實驗探索ZNF207在HCC中的作用，并使用公共數據進行驗證，發現ZNF207作為聯合治療靶點的潛力。眾多的基因中如何找到最關鍵的那一個，逐一用實驗驗證大大增加了我們實驗的成本。我們可以明確實驗目的，選擇合適的方法，結合生物信息手段，快速鎖定目標，讓我們的工作少走彎路！
