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SARS-CoV-2激活肺上皮細胞促炎癥信號轉導導致新冠肺炎患者免疫失調
這篇文章發表在期刊: Ebiomedicine。2021影響因子: 8.143(↑ 2.407)。2020影響因子: 5.736。中科院大類: 醫學 2區。中科院小類: 1區 醫學：研究與實驗。筆者認為新冠病毒這一話題為最近的熱點，而本篇文章利用了生信分析的方式，很好的展示了熱點話題，非常具有特色。很值得我們學習。
由SARS-CoV-2感染引發的2019年冠狀病毒病(新冠肺炎)暴發已成為全球性衛生突發事件。SARS-CoV-2屬于冠狀病毒家族。SARS-CoV-2與表面表達的蛋白--血管緊張素轉換酶2(ACE2)結合，進入與SARS-CoV相似的細胞。除了ACE2外，靶細胞上絲氨酸蛋白酶TMPRSS2的表達也是激活病毒刺突(S)蛋白以促進病毒進入所必需的。在這項研究中，作者綜合評估了19例受試者(6例新冠肺炎重癥患者，3例新冠肺炎輕度癥狀康復患者和10例健康獻血員)支氣管肺泡灌洗液中的單細胞測序數據。
目前還不清楚SARS-CoV-2感染是如何導致新冠肺炎患者肺部免疫反應失調的。
在SARS-CoV-2感染的不同細胞類型中， 檢測與SARS-CoV-2進入細胞有關的基因ACE2和TMPRSS2，肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)的單細胞RNA序列(scRNA-seq)數據來自NCBI數據庫中3例輕度恢復者和6例重癥患者(GSE145926)以及10名健康獻血者(GSE151928)。無監督聚類分析鑒定出23個不同的細胞簇（Fig. 1A），包括上皮細胞(EPCAM+)和免疫細胞(PTPRC+)。ACE2和TMPRSS2主要在肺上皮細胞表達(Fig. 1B)。在肺上皮細胞中，ACE2和TMPRSS2陽性細胞在棒狀細胞和纖毛細胞中所占比例較高，所以這些細胞可能是SARS-CoV-2感染的主要靶細胞(Fig. 1C)。值得注意的是，無論是重度還是輕度新冠肺炎患者的肺泡灌洗液樣本中，這兩種類型的肺上皮細胞中ACE2或TMPRSS2陽性細胞的百分比都顯著高于健康對照組(Fig. 1D)。與上述一致，新冠肺炎患者棒狀細胞和纖毛細胞中ACE2或TMPRSS2 mRNA的表達水平顯著高于健康對照組(Fig. 1E)。然而，考慮到本研究樣本量較小以及對這些患者的治療，新冠肺炎患者肺上皮細胞中ACE2和TMPRSS2的表達增加與SARS-CoV-2感染之間的相關性還需要進一步深入的研究。
Fig. 1. High ACE2 and TMPRSS2 expression in lung epithelial cells from COVID-19 patients. (A) The t-SNE plot displayed the major cell types (epithelial, immune and others) in 23 clusters for bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples from 6 severe (S) and 3 recovered mild COVID-19 patients (M), as well as 10 healthy controls (HC). (B) The t-SNE plot displayed RNA expression of ACE2 or TMPRSS2. Right panel shows ACE2 or TMPRSS2 expression in lung epithelial cells from different groups using violin plot. (C) Dot plot of ACE2 orTMPRSS2 expression for each cell-type of lung epithelial cells from different groups. Dot size represents the percentage of cells in individual clusters expressing a given gene. (D)The pie chart shows the percentages of ACE2- o r TMPRSS2- positive cells in club (cluster 14) and ciliated (cluster 15) cells. (E) Violin plot of expression values of ACE2 or TMPRSS2 in different cell types of lung epithelial cells from different group. (F) The top 5 enriched signaling pathways of up-regulated (red) or down-regulated (green) genes in lung epithelial cells after SARS-CoV-2 infection (severe vs. health). * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
接下來，作者研究了SARS-CoV-2感染后肺上皮細胞的細胞轉錄組改變。在棒狀細胞中，與健康對照組相比，重度新冠肺炎患者共檢測到107個上調轉錄本和65個下調轉錄本(校正≤p0.0 1和|log2Fold change(FC)|≥1)。另一方面，在纖毛細胞中檢測到SARS-CoV-2感染后162個上調轉錄本和138個下調轉錄本(校正≤p0.0 1和|log2Fold change(FC)|≥1)。(Fig. 1F)。另一方面，SARS-CoV2能夠抑制棒狀細胞中宿主蛋白的翻譯(Fig. 1F)。
此外，對輕癥和重癥新冠肺炎患者肺上皮細胞轉錄組的比較分析表明，與重癥患者相比，輕癥患者會誘導T細胞活化信號，如MHCⅡ類抗原提呈、CD3和TCR zeta鏈磷酸化，同時會抑制細胞因子信號轉導。與健康對照組相比，重癥新冠肺炎患者肺上皮細胞中主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類基因，包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP和HLA-DM顯著降低。這可能部分解釋了T細胞誘導失敗和患者預后差的原因。另一方面，在輕度恢復的COVID19患者中，MHCⅡ類基因的表達恢復。
作者進一步研究了SARS-CoV-2感染對免疫細胞命運的影響。將非上皮細胞重新聚為22個亞群，并基于標志物鑒定出不同的免疫細胞類型。如圖Fig. 1B和Fig. 2A所示，新冠肺炎患者支氣管肺泡灌洗液中的免疫細胞幾乎不表達ACE2和TMPRSS2，提示免疫細胞對SARS-CoV-2感染可能不敏感。接下來，作者研究了三個巨噬細胞亞群(第2、3和6群)，兩個T&NK細胞亞群(第4和5群)，以及一個中性粒細胞亞群(第0群)，因為它們包含了足夠的細胞數量進行分析。亞群特異性基因的過度表達分析顯示MHCⅡ類抗原提呈信號在巨噬細胞_2和巨噬細胞_6中被激活；相反，巨噬細胞_3可以發揮補體效應功能(Fig. 2B)。作者還利用SCIENIC研究了不同上皮細胞和免疫細胞亞型之間轉錄因子(TF)調節活性的差異，與特定細胞類型相關的多種轉錄因子(TF)表現出豐富的調節活性，包括巨噬細胞亞群中的TCF7L2，T和NK亞群中的GATA3和NFATC2。通過比較新冠肺炎患者和健康對照的不同免疫細胞群，作者發現SARS-CoV-2感染后肺部存在免疫應答失調(Fig. 2C) 與健康對照組相比，新冠肺炎重癥患者中性粒細胞水平顯著升高，但在患者康復后，中性粒細胞水平恢復到正常水平(Fig. 2C)。雖然重癥新冠肺炎患者的巨噬細胞數量(第3和第6簇)明顯低于健康對照組，但在康復患者中它們已恢復(Fig. 2C)。同時，與健康對照組相比，只有已經康復的、輕癥的新冠肺炎患者才能誘導T/NK細胞(圖2C)。
然后，作者探索了新冠肺炎患者和健康對照組肺內免疫細胞的差異基因表達譜。作者發現重癥新冠肺炎患者、輕度康復新冠肺炎患者和健康對照組中性粒細胞、巨噬細胞和T/NK細胞的基因表達譜存在差異(Fig. 2D)。在重癥新冠肺炎患者中，中性粒細胞、巨噬細胞和T/NK細胞(CCL2、CCL3、CCL3L1、CCL4和CCL4L2)以及中性粒細胞和巨噬細胞(CCL7和CXCL8)中的多種細胞因子均顯著升高(Fig. 2D)。SARS-CoV-2感染引起的免疫細胞功能紊亂所產生的這些細胞因子的高表達提示這些患者發生了細胞因子風暴。值得注意的是，FABP4在健康對照組和輕癥患者的巨噬細胞_2中高表達，而重度新冠肺炎患者的巨噬細胞2中FABP4的表達水平較高。相比之下，重癥新冠肺炎患者的巨噬細胞(第2、3和6簇)中SPP1高表達。(Fig. 2D). 此外，在重癥新冠肺炎患者的巨噬細胞中，Marco的表達受到抑制，這意味著感染SARS-CoV-2后的肺泡巨噬細胞可能無法清除中和病毒(Fig. 2D)。
Fig. 2. SARS-CoV-2 infection induced imbalanced host immune response in severe COVID-19 patients. (A) Dot plot of ACE2 or TMPRSS2 expression for each cell-type of lung immune cells from different groups. Dot size represents the percentage of cells in individual clusters expressing a given gene. (B) Top 5 enriched signaling pathways of markers genes for macrophage (cluster 2, 3 and 6). (C) The percentages of different immune cell types of all CD45+ cells in BALF of severe (S), recovered mild COVID-19 patients (M), and healthy controls (HC). (D) Heatmaps of transcript level of candidate genes in different immune cell types. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
接下來，作者利用CellPhoneDB研究了基于不同上皮細胞和免疫細胞之間配體受體的肺內細胞間交流信息。計算出顯著的細胞相互作用(P < 0.05)作者發現，與健康對照組相比，新冠肺炎患者的棒狀-免疫細胞相互作用(Fig. 3A)顯著增加，但纖毛-免疫細胞相互作用(Fig. 3B)并未顯著增加。至于免疫-免疫細胞，輕癥患者的BALF樣本比重癥患者和健康供者的BALF樣本表現出更多的細胞相互作用(Fig. 3C)。為了了解這些相互作用是否與新冠肺炎的嚴重程度相關，作者進一步研究了上皮細胞和免疫細胞之間特定的細胞因子/受體相互作用。作者在重度新冠肺炎患者中發現了與巨噬細胞(或中性粒細胞)之間的ANXA1/FPR2和TNFSF13/TNFRSF1A相互作用，以及與T/NK細胞之間的CXCL2/DPP4相互作用，而在輕度患者和健康對照組中沒有發現。這表明肺上皮細胞和免疫細胞之間的細胞因子/受體相互作用與新冠肺炎感染的嚴重程度有關(Fig. 3D)。SARS-CoV-2可能通過DPP4進入宿主細胞，并且抑制DPP4可能使患有新冠肺炎的糖尿病患者受益。此外，作者發現SARS-CoV-2感染誘導了C3/C3AR1和SAA1/FPR2在肺上皮細胞(棒狀和纖毛狀)與巨噬細胞(或中性粒細胞)之間的相互作用。重癥新冠肺炎患者巨噬細胞間ANXA1/FPR2相互作用缺失；在輕度患者中，巨噬細胞與T/NK細胞之間存在TNFSF13/TNFRSF1A相互作用，而在重癥患者和健康獻血者中未見(Fig. 3D)。作者進一步驗證了SARS-CoV-2感染后肺上皮細胞ANXA1、C3、CXCL2、SAA1和TNFSF13的表達。結果表明，重癥新冠肺炎患者肺上皮細胞中ANXA1、C3和SAA1的表達均顯著高于正常對照組。SARS-CoV-2感染后肺上皮細胞中CXCL2的表達呈上升趨勢，而TNFSF13的表達無明顯變化，作者的結果，提示SARS-CoV-2感染后，肺內上皮細胞和免疫細胞之間形成了特異性網絡，這可能與COVID19感染的嚴重程度有關。
Fig.3. SARS-CoV-2 infection resulted in abnormal epithelial-immune cell interaction in lung. (A-C) We evaluated intercellular communications based on expression of ligand receptor pairs among different cell types by CellPhoneDB. Club-immune cells (A), ciliated-immune cells (B), and immune-immune communications (C) in severe (S, n=6),recovered mild (M, n=3) COVID-19 patients, and healthy controls (HC, n=10) were shown. Only significant interactions were calculated, and the number of interactions was depicted in violin plot, or normalized against those of healthy controls in heatmap. (C) Heat map depicting different ligand receptor interactions among different cell types. Interaction strengths are color coded. [One-way Analysis of Variance (ANOVA) followed by Tukey multiple comparisons (A-C)]. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001.
總之，SARS-CoV-2感染可誘導高表達ACE2和TMPRSS2的肺上皮細胞(纖毛上皮細胞和桿狀上皮細胞)基因表達譜異常和促炎信號激活。此外，SARS-CoV-2感染導致肺部免疫反應失調，產生大量促炎因子，破壞上皮細胞和免疫細胞之間的相互作用。所有這些都加劇了新冠肺炎感染的嚴重性(Fig. 4)。
Fig. 4. SARS-CoV-2 infection and host immune response in COVID-19 patients. In COVID-19 patients, the SARS-CoV-2 may infect ciliated cells, club cells, and basal cells expressing ACE2 and TMPRSS2 in lung epithelium and actively replicate in host cells. This could lead to activation of pro-inflammatory signaling and production of pro-inflammatory cytokines which subsequently attract both innate and adaptive immune cells including neutrophils, macrophages and T cells to the infection site to fight virus and virus-infected cells. Besides, the immune cells also release cytokines to attract more immune cells, creating a positive feedback loop of cytokine creation. Massive accumulation of pro-inflammatory cytokines producing-immune cells in the lungs could increase the severity of COVID-19 patients.
