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癌癥治療中的一個關鍵挑戰是檢測可能具有耐藥性的稀有細胞亞群。隨著高分辨率微陣列和測序技術的快速發展，增加了我們對卵巢上皮性腫瘤標志物的了解。今天給大家分享的這篇文獻是發表于Oncogene（IF: 9.867）上的關于卵巢上皮性腫瘤的單細胞轉錄組結合常規轉錄組的一項研究，提供了不可多得的卵巢上皮性腫瘤的單細胞測序數據，同時我們也可以一起來學習一下這篇文章的研究思路。
單細胞RNA-seq識別卵巢上皮性腫瘤復發的起因
研究背景
卵巢上皮性腫瘤（EOC）是所有婦科癌癥中最致命的癌癥類型。由于早期無癥狀，80%以上的EOC患者晚期(III或IV期)才被確診并伴有腹膜轉移現象。EOC對化療藥物高度敏感，但是復發率也高。在大多數晚期EOC患者中，中位無復發間隔期（RFI）為16-22個月，5年生存率<30%。在幾乎所有癌癥類型中，轉移性復發是癌癥相關死亡的主要原因。從原發性腫瘤中逃逸出來的播散腫瘤細胞（DTC）和播散腫瘤細胞群被認為是轉移的起因，此外，腫瘤轉移還與腫瘤微環境（TME）以及上皮-間質轉化（EMT）相關。因此研究人員提出識別出EOC中這一關鍵的腫瘤細胞亞群可能為預防復發的治療干預提供新的靶點。
結果
1. 卵巢上皮性腫瘤單細胞圖譜
作者首先對8個卵巢上皮性腫瘤（EOC）患者樣本的13369個細胞進行了單細胞轉錄組測序，其中包括四個原發腫瘤（Ps）、兩個未經治療的腹膜轉移腫瘤（Ms）和兩個復發腫瘤（Rs）（圖1a）。通過無監督共識聚類共鑒定出14個不同的細胞類群，其中有8個細胞群中的細胞主要來源于同一個樣本（圖1b），且這8個細胞群都是上皮起源（EPCAM）。其他6個細胞群由來自不同患者的細胞組成。如圖1c所示，通過對已知標記基因的分析可以確定這6個細胞群分別為癌相關成纖維細胞（CAF，包含兩個群）、T細胞、巨噬細胞、內皮細胞和正常卵巢組織細胞。
目前主要有兩種方法鑒定上皮腫瘤細胞：一種是基于拷貝數變化和點突變，另一種則是基于上皮細胞標記基因的表達情況。從圖1c中可以觀察到上皮細胞標記基因和其他細胞類型標記基因的表達顯著不同，因此作者認為上皮起源的8個細胞群是腫瘤細胞，其他細胞群則被歸類為基質細胞，即共鑒定出了10364個腫瘤細胞和3005個基質細胞（圖1d）。作者還注意到，腫瘤細胞主要根據其樣本來源進行聚集，而基質細胞則主要根據其特定的細胞類型進行聚集，每個細胞群中包含來自不同樣本的細胞，這一現象說明癌癥患者的個體間異質性非常顯著。
對基質細胞的進一步聚類分析顯示，根據其基因表達差異，THY1+ CAF有兩個亞群，而CD2+ T細胞可根據T細胞表達狀態分為細胞毒性T細胞和耗竭性T細胞。如圖1e，每種細胞類型的比例在不同的腫瘤類型中差異很大。例如，在未經治療的腹膜轉移腫瘤中，腫瘤浸潤免疫細胞的比例遠高于其他腫瘤類型，而在所有腫瘤類型中，復發腫瘤中的腫瘤細胞比例最高。
2. 對轉移瘤進行細胞軌跡分析以確定起始細胞
為了揭示兩種未經治療的腹膜轉移瘤（M1、M2）和兩種復發瘤（R1、R2）中腫瘤細胞的發育順序，作者使用基于不同原理的兩種無監督算法進行了獨立的細胞軌跡分析。第一種算法是“RNA速度”分析，它可以通過區分scRNA-seq數據中未剪切的和成熟的mRNA的相對豐度，以預測單個細胞的發育（圖2a-d）。第二種算法是Monocle擬時間分析，它可以定量測量單細胞在生物過程中的進展，尤其是增殖和分化，通過發育調控基因表達的變化確定細胞命運（圖2e-h）。每個轉移性腫瘤的細胞根據擬時間軌跡排列（圖2i–l，頂部軌跡），擬時間起始分支上的細胞則被定義為所有后續細胞的起始細胞亞群。為了比較這兩種算法的結果，作者還使用RNA速率識別的細胞群的名稱沿擬時間軌跡給細胞著色（圖2i–l，中間軌跡）。結果發現每個腫瘤細胞群的預測偽時間順序與其估計的細胞狀態速度一致。綜合上述結果，兩種算法起始位置中出現的重疊細胞被確定為每個轉移性EOC腫瘤中起始細胞（圖2i–l，底部軌跡，橢圓中的紅色細胞群）。
作者又對保守標記基因進行了功能分析，結果表明，未經治療的腹膜轉移瘤（M1、M2）中的起始細胞主要與免疫反應有關（如CD81、HLA-A、HLA-DRB1、XBP1、CFB、C3），復發腫瘤（R1、R2）中的起始細胞則主要與細胞周期有關（如MKI67、CKS2、ANLN、CDC20、CDCA8、CENPF）（圖3a）。在這兩種轉移性腫瘤之間并沒有發現共同的轉錄特征，但它們中的免疫細胞比例都相當高，而在任何復發腫瘤樣本中幾乎沒有觀察到免疫細胞（圖1e）。作者在進一步對腹膜轉移腫瘤中免疫應答基因的研究中發現T細胞和腫瘤細胞之間存在受體-配體相互作用，包括T細胞通過淋巴毒素和腫瘤壞死因子（TNF）介導的細胞毒性以及腫瘤細胞通過趨化因子介導的T細胞募集（圖3b）。此外，在兩個復發性腫瘤樣本中，G1/S或G2/M期細胞在起始細胞群中富集，但在腹膜轉移腫瘤中少見且分散存在（圖3c）。
3. 追蹤原發性腫瘤中的轉移起始細胞
為了追蹤原發性腫瘤中轉移起始細胞的來源，作者首先分析了每個原發性EOC樣本中腫瘤細胞的基因表達情況。通過無監督聚類，從四種原發性腫瘤中鑒定出了23個特征基因。為了對這些特征基因進行功能注釋，作者對前100個共表達基因進行GO富集分析，一共定義了7種類型基因表達模式（如圖3d）。然后作者又重新定義了四種原發性腫瘤中保守的轉移起始特征基因，繪制了轉移起始基因集或復發起始基因集（圖3f）的單細胞表達評分（圖3e-f），發現復發起始特征基因在“cycling”或“stress”類型中富集（圖3f）。上述結果表明，任何類型的腫瘤細胞都可以在化療前進行轉移，但是只有特定的腫瘤細胞亞群可以在化療后存活，從而引發腫瘤復發。
通過之前的分析，復發腫瘤中的起始細胞被證明是cycling細胞。然而，引發復發的DTCs不太可能起源于原發腫瘤的cycling亞群，因為原發腫瘤中的cycling細胞是化療的靶點，且其生存幾率較低。因此作者猜測可能是non-cycling 或者 low-cycling的DTCs在藥物治療后存活下來，并獲得進入細胞周期的能力，從而引起了腫瘤的復發。為了揭示cycling類型復發起始細胞的基因表達情況，作者將復發腫瘤的起始細胞與原發腫瘤的cycling細胞進行了比較。在復發腫瘤的起始細胞中鑒定了45個基因（圖4a），這些基因主要與色素顆粒、應激反應和蛋白質折疊功能有關。圖4b的t-SNE圖譜顯示了這45個標記基因在四個原發性EOC腫瘤表達水平。
4. CYR61在復發起始因子中高度表達，并與耐藥性相關
作者根據耐藥性特征以及Puram等人報道的腫瘤內部分EMT（p-EMT）特征，評估了“stress”亞群中腫瘤細胞的復發相關特性。與來自其他腫瘤內基因表達模式的腫瘤細胞亞群相比，“stress”亞群具有相對較高的耐藥性得分（圖4c）。因此EOC的復發始作俑者很可能是來自原發腫瘤的“stress”亞群，這可能是防止EOC復發的一個重要治療靶點。于是作者分別從四種原發腫瘤的“stress”亞群中鑒定出12、7、13和22個標記基因；鑒定標準有兩個，一個是在“stress”亞群中超過30%的細胞中表達，第二個則是在其他亞群中無表達或低表達。其中CYR61被確定為四個EOC患者樣本中“stress”亞群的常見生物標記物（圖4d-e）。
CYR61編碼的是一種分泌的細胞外基質（ECM）相關蛋白，調節多種細胞功能，包括細胞粘附、遷移、增殖、凋亡、衰老和分化，CYR61表達已被證明在多種癌癥中與耐藥性相關。作者通過基因網絡互作分析進一步明確了幾個耐藥基因信號通路和CYR61表達之間的直接和間接聯系（圖4f）。CYR61染色結果顯示，與原發腫瘤相比，復發腫瘤中的CYR61+細胞百分比顯著升高（>80%）（圖4g）。CYR61+細胞的高百分比與腫瘤細胞的耐藥性增加呈現正相關性（圖4h）。此外，作者還進行了GSEA分析，結果發現CYR61+細胞亞群和復發起始亞群都表現出20種耐藥相關途徑的顯著上調（圖4i）。
5. RGS5+CAF亞群促進腫瘤細胞的轉移
作者為了探究腫瘤組織中CYR61的總體表達水平，進一步分析了8個EOC樣本的bulk RNA-seq數據，鑒定出了12個應激相關基因（包括CYR61），并觀察到許多與CAF相關的ECM編碼基因（如COL1A1、COL1A2、COL3A1、FN1）高表達（圖5a）。根據不同的基因表達情況，作者將EOC中的CAF細分為兩個亞群。富集分析顯示，CAF2的標記基因在ECM和細胞粘附功能中富集，而CAF1的標記基因在響應刺激、血管生成和抗凋亡等功能中富集（圖5b）。因此，作者認為CAF，尤其是CAF1，是原位腫瘤生長和癌細胞轉移擴散關鍵因素（圖5c）。
相關性分析顯示，整個腫瘤組織的EMT評分與CAF1與腫瘤細胞的比率高度正相關，同時純腫瘤細胞的EMT評分與CAF1的數量也顯著相關（圖5d-g）。作者進一步探索了8個EOC樣本中最具代表性的CAF1生物標記物，發現兩個候選基因RGS5和COL4A1在CAF1中高表達，通過比較這兩個基因在CAF群中的表達特異性，最后RGS5被確定為CAF1中特異性的生物標記物（圖5h-j）。
6. CYR61/RGS5表達水平反映了EOC的RFI
在確定了兩個腫瘤內細胞亞群的生物標記物后，作者首先在8個EOC樣本中進行CYR61和RGS5的IHC聯合染色，以驗證樣本制備和scRNA-seq數據分析的可靠性（圖6a）。很明顯，IHC結果中CYR61腫瘤細胞和RGS5+CAF的百分比與scRNA-seq結果中的百分比一致，并驗證了CAF1通過腫瘤細胞TME相互作用促進腫瘤細胞的EMT。對比EOC的組織學亞型在EOC RFI分析的分類能力，說明了從scRNAseq中發現的生物標記物在EOC的所有組織學亞型中具有很強的復發預測潛力（圖6d-f）。
小結
EOC對化療很敏感，但大多數患者最終會復發并產生耐藥性。認識原發性EOC腫瘤中的復發起始細胞對指導臨床實踐具有重要意義，作者通過采用scRNA-seq技術結合常規轉錄組數據分析克服了腫瘤個體之間異質性的影響，最后確定了在不同的EOC亞型中，復發通常是由特異性表達CYR61的耐藥原發腫瘤細胞亞群引起的。此外，還發現RGS5+CAF亞群對腫瘤轉移有促進作用。
