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大家好呀，小編今天給大家帶來的是2022年9月發表在nature communications(IF=17.694)上的一篇研究。作者通過研究RAS癌基因的活性，在肺腺癌中構建了RAS84 成功預測了患者的預后及化療反應。提前劇透一下，大部分是我們熟知的TCGA等公共數據哦！快來一起看看，作者是如何通過分析公共數據將文章登錄NC的吧！
一.研究背景
RAS癌基因在近20%的人類癌癥中發生突變，并作為腫瘤形成和進展的驅動因素，KRAS是突變率最高的RAS亞型。大量的研究描述了突變KRAS在腫瘤侵襲性、轉移和化療耐藥中的重要作用，但是關于KRAS突變對患者結局或化療應答的預測價值在發表的研究中缺乏共識。在作者之前的研究中，作者通過人和小鼠肺腺癌模型證明了KRAS突變促進PD-L1表達，導致免疫逃逸。由于根據KRAS突變狀態對患者進行的獨特分層可能使在大型患者隊列中進行的RAS突變研究變得復雜，于是作者提出了一種基于RAS調控的轉錄活性的分層方法，預測肺腺癌和其他實體癌的預后和治療反應。在這篇研究中，作者獲得了一個基因signature定義為RAS84，并構建了一個分類器，通過腫瘤患者中RAS84的表達對患者進行分層。通過這種方法，作者發現RAS轉錄活性可以預測肺腺癌和其他幾種實體癌的臨床結局。該方法提供了在大隊列患者中研究致癌RAS活性的影響的可能性，并有助于預測與致癌RAS活性相關的治療敏感性。
二.主要結果
由于KRAS可以改變并影響RAS通路活性，為了克服這一問題，作者首先從已發表的數據以及作者針對KRAS和sh-KRAS數據重組的HCT116細胞系中確定RAS靶基因。主要關注的是RAS信號激活背景下上調的基因，因為大多數signature只有上調的基因；為了減少腫瘤浸潤免疫細胞的混雜信號的可能性，作者刪除了兩個免疫signature中的所有基因；最終確定的所有基因都由RAS的靶基因組成，與其他研究的signature幾乎沒有重疊。
1.利用肺細胞系表達數據構建RAS84
作者最初的目標是測量腫瘤細胞中的RAS通路活性。因此，作者將已建立的signature映射到CCLE的肺癌細胞系數據上，用來確定在不含基質細胞和免疫細胞的樣本中那些signature準確的測定了致癌RAS的活性，以及已知KRAS突變是主要癌癥驅動因素。作者首先通過去除細胞系中低表達的基因來清理特征，并刪除了除KRAS外具有致癌RAS通路突變的細胞系，將過濾后的CCLE肺癌細胞系特征表達矩陣聚類為三組。根據組內signature基因的平均表達量將cluster命名為高RAS和低RAS，并將平均表達量中等的樣本組歸類為“未分類”。
利用KRAS突變在高RAS和低RAS基因簇中的分布來評估signature捕獲RAS致癌活性的能力，作者發現“RAS通路”、“KRASG13D134”和“HRAS”是在高RAS組中富集KRAS突變的最佳signature(圖1a)。接下來作者對這些組進行了差異基因分析，以確定在RAS高表達組細胞中上調的signature基因，進一步改進上述三個signature。從這些基因中，構建了RAS84 signature，并在CCLE的肺癌數據集上進行了測試(圖1b)。
RAS84成功將42株KRAS突變株中的36株納入RAS高表達組，6株未分類，0株為RAS低表達組。當與其他RAS和致癌signature比較時，RAS84給出了統計上最可靠的KRAS突變細胞系與RAS-low組的分離(圖1d)。
2.RAS84表達可以在體外預測藥物敏感性和耐藥
為了確定RAS84的表達是否與抗癌藥物反應相關，作者在RAS高和低的CCLE細胞系分組下分析了來自GDSC和CTRP數據庫的藥物敏感性數據，確定了兩組之間有差異應答的藥物(圖2a)，并對不同反應的藥物進行了藥物靶標terms富集(圖2b)。作者發現RAS高的細胞系對靶向ERK MAPK和EGFR信號通路的藥物敏感，也對蛋白穩定性和降解的藥物敏感；DNA復制和有絲分裂是常見的化療靶點，表明RAS84活性在體外與化療耐藥相關。作者還檢測了KRAS突變(圖2c)和RAS通路突變依賴的藥物應答(圖2d)，結果發現兩個突變組只對三種靶向ERK MAPK信號傳導的藥物敏感且未觀察到對任何藥物的耐藥性。這一結果表明，RAS84比單獨的KRAS突變或更廣泛的RAS通路突變更好地捕捉了RAS驅動的藥物反應。
3.肺腺癌中RAS84表達與KRAS突變相關
為了在細胞系之外進一步驗證RAS84，作者將其應用于TCGA的LUAD數據上。鑒于與細胞系數據相比，在患者腫瘤樣本中觀察到的signature表達的異質性增加，作者探索了不同于細胞系數據三分類的患者聚類，將TCGA數據的樣本聚類分成了五組(RAG0-4)(圖3a)，發現RAS84表達最低的一組中KRAS突變計數較低，其他的聚類都有高水平的KRAS突變，在25%到45%之間(圖3b)。作者使用上述各種特征對患者進行了重新分組，發現RAS84對KRAS突變腫瘤分類最佳(圖3c)。
作者將每個患者RAS84基因的平均表達量定義為RAS84-Index(RI)值。為了進一步確定這些組的特征，作者研究了在5個cluster中是否有其他報告的基因組改變表現出非隨機分布。確定了在一個或多個RAS activity groups (RAGs)中富集的8個突變(圖3d)，并使用這些與聚類相關的突變來表征五種RAGs。作者在一個包含87例肺腺癌患者的獨立隊列中驗證了KRAS,EGFR和TP53在RAGs中的突變模式(圖3e)。
為了確定RAS84的表達是否反映了RAS-MAPK信號的活性，作者使用癌癥蛋白質組圖譜(TCPA)反相蛋白陣列(RPPA)數據32對349例TCGA LUAD患者進行了研究，發現與RAG-0相比，所有RAGs中一個或兩個蛋白的磷酸化增加(圖3f)。作者還確定了那些RAS84基因驅動了RAGs，通過與聚類中變異最大的基因進行相關性分析，發現7個小的基因cluster可以區分5個RAGs(圖3g)。綜上，作者證明RAS84在將KRAS突變型肺腺癌分類為具有RAS驅動轉錄活性的腫瘤方面表現最佳。
4.RAS84的表達大多是克隆性的
接下來的研究，作者主要探討RAS84的預后價值。理想情況下，可靠的生物標志物不應受到采樣區域的影響，因此不應受到大多數癌癥中觀察到的腫瘤內異質性的干擾。于是為了評估肺腺癌中RAS活性的腫瘤內異質性，作者將來自多區域TRACERx隊列的樣本分為5個RAS活性組(來自41例患者的102個樣本)；通過TCGA LUAD分類結果訓練支持向量機(SVM)分類器，并使用該分類器為TRACERx樣本分配RAG標簽(圖4a)。作者觀察到與腫瘤間距離分布相比，RAS84在這些跨組腫瘤中的腫瘤內差距仍然很小(圖4b)。
接下來作者通過與TRACERx肺腺癌隊列中先前注釋的表達異質性的基因集進行比較，評估了RAS84基因在腫瘤內和腫瘤間的表達差異。先前的研究將所有表達的基因根據它們在腫瘤內和腫瘤間的表達差異分為四組。作者發現RAS84基因在低腫瘤內、高腫瘤間表達差異組中顯著富集3.2倍(圖4c)。這表明RAS84富集了抗樣本偏倚的基因。總之，這些數據表明RAS轉錄活性主要由肺腺癌腫瘤中克隆表達的基因組成，可能反映了RAS通路的致癌驅動能力；并且面對抽樣偏差，RAS84特征可能是相對穩健的。
5.RAS84預測肺腺癌患者的生存和化療反應
在許多臨床前模型中，突變的KRAS癌基因促進腫瘤進展和轉移，但在臨床數據集中，KRAS突變狀態與預后并不可靠的相關(圖5a)。為了確定RAS84在肺腺癌中是否具有預后價值，作者進行了單變量Cox比例風險分析，比較了TCGA LUAD RAGs的總生存期和無進展生存期。作者發現我們發現與RAG-0相比，RAG-4在總生存期和無進展生存期均與陰性結果顯著相關(圖5b、c)。
作者還對RAS84 RAS指數(RI)值進行了單因素Cox比例風險回歸模型分析。作者發現與預后顯著正相關，表明RAS84表達增加是總生存率較差的預測因素。為了可視化RI預測結果的能力，作者使用該模型在RI值增加或減少兩倍的情況下預測生存時間(圖5d)，研究表明RAG是預后的重要預測因子，特別是RAG-4、RAG-3和RI與不良預后顯著相關(圖5e-h)；在校正其他預后預測因子的多變量分析中，結果表明只有RAS84顯著預測了預后(圖5i)。這表明RAS84在早期肺腺癌中具有超越已知臨床預測因子的預后特性，并提示RAS通路活性可以促進人類肺腺癌的腫瘤進展。
由于在體外觀察到一種化療耐藥表型，作者使用腺癌患者的TEMPUS隊列進行了PFS多變量Cox比例風險分析，作者選擇了接受過一線化療的患者，并利用患者記錄構建了PFS間期。結果表明RAG是化療后PFS的重要預測因子，與RAG-2相比，RAG-3和RAG-4患者的反應較差(圖5j)。最后，作者將RAS84與已發表的RAS特征進行比較，以預測對化療的反應，結果未能顯示RAS活性與治療耐藥的相關性(圖5k)。綜上，作者在來自兩個獨立隊列的500多名肺腺癌患者中證明了RAG分類和RI量化的預后價值，還將RAG分類作為治療應答的預測因子，從而證明了RAS84作為臨床危險因素和應答生物標志物的價值。
6.RAS84可預測不同癌癥類型的RAS-MAPK通路活性
RAS活性在腫瘤發生和癌癥進展中的重要程度因不同組織而異，已知一些癌癥主要是由RAS突變驅動，如胰腺癌、結直腸癌和肺癌。為了研究RAS84確定的RAS活性在不同癌癥類型之間的差異，作者在泛癌分析中量化了RAS84對所有32種TCGA實體癌的作用為了比較不同癌癥的樣本，作者計算了每個樣本的RI值(圖6a)，通過從每種癌癥的平均RI值分布中確定了兩種不同的癌癥人群(圖6b)。結果表明，在RAS高活性組中前五種RAS突變癌癥中有四種是RAS驅動的(RAS基因突變率: 胰腺癌(PAAD) 71%,結腸腺癌(COAD) 50%,直腸腺癌(READ) 49%,肺腺癌(LUAD) 31%)。
接下來作者將RAS通路改變狀態定義為至少一種RAS通路基因改變導致通路激活的患者數量。通過相關性分析發現(圖6c)，胃癌(STAD)，膀胱癌(BLCA)，頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)，食管癌(ESCA)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)的RAS通路改變率均超過50%，表明是RAS通路的改變而不是RAS在這些癌癥中驅動活性。圖6d顯示，在SKCM中RAS突變與RI不相關，而在THCA中呈現顯著的負相關(圖6d)，這表明突變的RAS并不是這些癌癥中RAS通路活性的主要驅動因素；作者還發現BRAF突變與高RI值顯著相關(圖6e)，這表明BRAF是這兩種癌癥中致癌RAS通路活性的關鍵驅動因素。作者確定RAS84表達除LUAD外與CESC和PAAD的預后相關(圖6f、g)。這一結果表明，RAS84定義的RAS活性在其他RAS驅動的癌癥(如胰腺癌(PAAD))和RAS通路活性的癌癥(如宮頸癌(CESC))中可能是一個預后指標。
至此，這篇文章就介紹完啦，內容較多，我們來總結一下：第一步作者先在先前的研究基礎上確定了RAS的靶基因，并在肺癌細胞系的表達數據中構建了RAS84；第二步，作者通過分析公共數據庫的藥物敏感性數據，確定了RAS84與藥物敏感型以及耐藥相關。第三步，作者在非體外的細胞系的TCGA等患者組織數據上進一步驗證RAS84效能，證明了其可以預測患者預后及化療反應的作用；最后，將其擴展到泛癌水平進行多個癌癥中的討論。整體思路是我們熟悉的biomarker的研究思路，單個癌癥的證明+泛癌水平的討論，而且數據大部分也都是我們耳熟能詳的TCGA等公共數據。然而，這篇文章在2022年依然可以登上NC，小編認為，這篇文章最大的亮點還是在于作者的書寫表達，作者對于每一個結果的闡述非常完整，做到每個結果有理有據有總結，結果間的邏輯承接絲滑流暢，是一篇難得的好文章，推薦大家下載原文進行閱讀學習哦！
