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大家好呀！今天給大家介紹一篇2021年發(fā)表在Molecular Therapy Oncolytics上的文章。乳腺癌是全世界范圍內(nèi)女性最常見的癌癥類型之一，三陰性乳腺癌（TNBC）占侵襲性乳腺癌的15%-20%。目前化療和手術(shù)是治療TNBC患者的主要手段。新輔助化療（NAC）主要用于保乳手術(shù)和消除臨床無癥狀微轉(zhuǎn)移。然而，在接受NAC的TNBC患者中僅有50%能夠達到完全緩解（pCR）和良好的無復(fù)發(fā)生存。本研究，作者對NAC有應(yīng)答和無應(yīng)答的TNBC患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，全面了解NAC耐藥性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄景觀。
Transcriptional landscape associated with TNBC resistance to neoadjuvant chemotherapy revealed by single-cell RNA-seq
單細胞轉(zhuǎn)錄組揭示與TNBC新輔助化療耐藥有關(guān)的轉(zhuǎn)錄景觀
摘要：
三陰性乳腺癌（TNBC）的新輔助化療（NAC）耐藥是目前一個主要的臨床挑戰(zhàn)，了解腫瘤異質(zhì)性可以為了解耐藥機制和潛在治療靶點提供新的信息。本研究作者對NAC應(yīng)答和無應(yīng)答患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，了解單細胞水平上與TNBC的NAC耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)錄環(huán)境，揭示腫瘤異質(zhì)性。根據(jù)迭代聚類，ICGC和UMAP算法對單細胞進行聚類，pre-NAC的基因特征主要與肺上皮細胞，乳腺細胞和髓系白血病母細胞的基因特征類似而post-NAC的基因特征主要與乳腺細胞和成纖維細胞的基因特征類似。這些基因特征與加強細胞運動，F(xiàn)OXM1，NOTCH1和MYC激活及抑制腫瘤壞死因子(TNF)和IFNG機制網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。此外，多因素生存分析鑒定到3-基因特征（KIF5BhighHLA-ClowIGHG2low）可以準確預(yù)測RFS。在無反應(yīng)組中沉默幾個上調(diào)基因的功能上是會抑制MDA-MB-231和BT-549 TNBC模型的CFU并增強了對紫杉醇的敏感性。作者的研究揭示了與NAC耐藥性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄景觀，鑒定到關(guān)鍵基因并揭示了其在TNBC中的預(yù)后和靶向治療的潛力。
結(jié)果：
1.數(shù)據(jù)集的獲取
從SRA數(shù)據(jù)庫下載單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，SRP114962。從SRA數(shù)據(jù)庫下載360例TNBC患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，SRP157974。
2.單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和ICGS揭示pre-NAC和post-NAC的TNBC腫瘤內(nèi)異質(zhì)性
為研究單細胞水平下TNBC的異質(zhì)性，作者對pre-NAC和post-NAC后4例有應(yīng)答和4例無應(yīng)答患者單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析。pre-NAC的有應(yīng)答組有719個細胞，無應(yīng)答組有525個細胞，post-NAC的有應(yīng)答組有894個細胞，無應(yīng)答組有687個細胞，共鑒定到13個簇（圖1A）。對pre-NAC和post-NAC組中每個細胞簇中的差異表達基因繪制聚類熱圖并進行GO富集分析（圖1A）。其中C1和C12主要存在于pre-NAC和post-NAC組中，而C5主要存在于pre-NAC中，C31,C22和C14主要富集于有應(yīng)答組中。UMAP分析共鑒定到13個簇（圖1B），其中C1和C2與其他簇具有顯著差異，與其他簇沒有重疊。
3.有應(yīng)答組和無應(yīng)答組的單細胞轉(zhuǎn)錄組比較分期揭示基因表達和GO富集存在顯著差異
聚類分析表明pre-NAC的有應(yīng)答組和無應(yīng)答組的單細胞在轉(zhuǎn)錄組水平具有顯著差異（圖2A）。在無應(yīng)答組中，干擾素γ反應(yīng)，基因表達和細胞死亡調(diào)控有關(guān)的GO term顯著富集，而細胞分裂調(diào)控，對蛋白質(zhì)刺激反應(yīng)和血清素代謝過程有關(guān)的GO term富集程度較低。在有應(yīng)答組中免疫反應(yīng)顯著富集。使用火山圖展示有應(yīng)答組和無應(yīng)答組的差異表達基因（圖2B）。作者對排名前10的上調(diào)基因和下調(diào)基因使用第二個數(shù)據(jù)集的pre-NAC的有應(yīng)答組和無應(yīng)答組的單細胞數(shù)據(jù)進行驗證（圖2C和2D）。
4.IPA揭示了有應(yīng)答組和無應(yīng)答組顯著差異的功能和通路
為進一步了解有應(yīng)答組和無應(yīng)答組富集的生物學(xué)通路，作者對上調(diào)基因進行IPA分析。在無應(yīng)答組中富集程度最高的20條通路如圖3A所示，主要涉及細胞器發(fā)育和細胞功能通路，包括增殖，遷移和入侵，氧化磷酸化，糖酵解，糖異生和膽固醇生物合成等。而應(yīng)答組中排名前20的下調(diào)通路主要參與樹突狀細胞成熟，T細胞信號通路，免疫應(yīng)答和BAG2信號通路等（圖3B）。應(yīng)答組中富集程度最高的功能主要為系統(tǒng)生長和細胞增殖（圖3C）。為進一步研究上游調(diào)控因子的下游功能，作者對無應(yīng)答組中上調(diào)基因使用IPA進行分析。構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)鑒定到7個上游調(diào)控因子，35個位于中間層次的基因（圖3D）。
5.有反應(yīng)組的免疫浸潤細胞差異
使用IPA分析應(yīng)答組的富集基因集，主要涉及免疫細胞轉(zhuǎn)運和細胞間信號相互作用（圖4A）。對pre-NAC和pre-NAC的應(yīng)答組和無應(yīng)答組的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，在應(yīng)答組中CD19,CD8A,CD4,CD52,CD2,CD53,CD59,CD47,CD74和CXCL9的表達水平更高（圖4B）。在post-NAC的應(yīng)答組中CD74+細胞的數(shù)量較多（圖4B）。為鑒定免疫滲透細胞在應(yīng)答組和無應(yīng)答組中是否存在功能差異，作者對CD45+EPCAM細胞的轉(zhuǎn)錄組進行IPA分析，結(jié)果表明應(yīng)答組的免疫細胞功能較強，表明無應(yīng)答組的免疫浸潤細胞功能受損（圖4C和4D）。
6.應(yīng)答組和無應(yīng)答組的基因與TNBC患者的生存的相關(guān)性
對應(yīng)答組和無應(yīng)答組進行差異分析鑒定到788個上調(diào)基因和244個下調(diào)基因（圖4）。對360例TNCB患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中應(yīng)答組和無應(yīng)答組的差異基因進行單因素生存分析，其中無應(yīng)答組中的上調(diào)基因與RFS較差有關(guān)（圖5A），而應(yīng)答組中的上調(diào)基因與預(yù)后較好有關(guān)（圖5B）。隨后，作者進行多因素Cox回歸分析，鑒定到3-基因模型（KIF5BhighHLA-ClowIGHG2low）可以準確預(yù)測RFS（圖5C）。3-基因模型的預(yù)測性能優(yōu)于一些臨床特征，例如腫瘤大小，年齡，亞型和治療方式等（表1）。
7.靶向消除無應(yīng)答組驅(qū)動基因會降低TNBC的形成和增強PTX敏感性
為研究驅(qū)動基因的機制和他們對PTX敏感性的作用，作者基于差異分析和通路分析選擇了10個基因進行進一步分析。使用782個應(yīng)答組和535個無應(yīng)答組的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證10個上調(diào)基因的表達水平（圖6A）。使用CCLE數(shù)據(jù)庫研究這10個基因在TNBC細胞系中的表達水平（圖6B）。在紫杉醇處理組和空白組中沉默BYSL和MYC會抑制TNBC的形成和增強PTX敏感性（圖6C-6E）。敲除FDPS,ENO1和PMVK會抑制TNBC的形成并增強PRX敏感性（圖6C-6F）。
結(jié)論：
本研究作者使用公共的TNBC的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析構(gòu)建了新輔助治療前后的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜并鑒定與TNBC的NAC耐藥相關(guān)關(guān)鍵基因。此外，作者使用公共的TNBC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析鑒定到3-基因模型可以準確預(yù)測TNBC患者的RFS。本研究為今后的TNBC的靶向治療提供有價值的信息。
