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大家好呀！今天給大家介紹一篇2021年發表在Molecular Therapy Oncolytics上的文章。乳腺癌是全世界范圍內女性最常見的癌癥類型之一，三陰性乳腺癌（TNBC）占侵襲性乳腺癌的15%-20%。目前化療和手術是治療TNBC患者的主要手段。新輔助化療（NAC）主要用于保乳手術和消除臨床無癥狀微轉移。然而，在接受NAC的TNBC患者中僅有50%能夠達到完全緩解（pCR）和良好的無復發生存。本研究，作者對NAC有應答和無應答的TNBC患者的單細胞轉錄組數據進行分析，全面了解NAC耐藥性有關的轉錄景觀。
Transcriptional landscape associated with TNBC resistance to neoadjuvant chemotherapy revealed by single-cell RNA-seq
單細胞轉錄組揭示與TNBC新輔助化療耐藥有關的轉錄景觀
摘要：
三陰性乳腺癌（TNBC）的新輔助化療（NAC）耐藥是目前一個主要的臨床挑戰，了解腫瘤異質性可以為了解耐藥機制和潛在治療靶點提供新的信息。本研究作者對NAC應答和無應答患者的單細胞轉錄組數據進行分析，了解單細胞水平上與TNBC的NAC耐藥相關轉錄環境，揭示腫瘤異質性。根據迭代聚類，ICGC和UMAP算法對單細胞進行聚類，pre-NAC的基因特征主要與肺上皮細胞，乳腺細胞和髓系白血病母細胞的基因特征類似而post-NAC的基因特征主要與乳腺細胞和成纖維細胞的基因特征類似。這些基因特征與加強細胞運動，FOXM1，NOTCH1和MYC激活及抑制腫瘤壞死因子(TNF)和IFNG機制網絡有關。此外，多因素生存分析鑒定到3-基因特征（KIF5BhighHLA-ClowIGHG2low）可以準確預測RFS。在無反應組中沉默幾個上調基因的功能上是會抑制MDA-MB-231和BT-549 TNBC模型的CFU并增強了對紫杉醇的敏感性。作者的研究揭示了與NAC耐藥性有關的轉錄景觀，鑒定到關鍵基因并揭示了其在TNBC中的預后和靶向治療的潛力。
結果：
1.數據集的獲取
從SRA數據庫下載單細胞轉錄組數據，SRP114962。從SRA數據庫下載360例TNBC患者的轉錄組數據，SRP157974。
2.單細胞轉錄組測序和ICGS揭示pre-NAC和post-NAC的TNBC腫瘤內異質性
為研究單細胞水平下TNBC的異質性，作者對pre-NAC和post-NAC后4例有應答和4例無應答患者單細胞轉錄組數據進行分析。pre-NAC的有應答組有719個細胞，無應答組有525個細胞，post-NAC的有應答組有894個細胞，無應答組有687個細胞，共鑒定到13個簇（圖1A）。對pre-NAC和post-NAC組中每個細胞簇中的差異表達基因繪制聚類熱圖并進行GO富集分析（圖1A）。其中C1和C12主要存在于pre-NAC和post-NAC組中，而C5主要存在于pre-NAC中，C31,C22和C14主要富集于有應答組中。UMAP分析共鑒定到13個簇（圖1B），其中C1和C2與其他簇具有顯著差異，與其他簇沒有重疊。
3.有應答組和無應答組的單細胞轉錄組比較分期揭示基因表達和GO富集存在顯著差異
聚類分析表明pre-NAC的有應答組和無應答組的單細胞在轉錄組水平具有顯著差異（圖2A）。在無應答組中，干擾素γ反應，基因表達和細胞死亡調控有關的GO term顯著富集，而細胞分裂調控，對蛋白質刺激反應和血清素代謝過程有關的GO term富集程度較低。在有應答組中免疫反應顯著富集。使用火山圖展示有應答組和無應答組的差異表達基因（圖2B）。作者對排名前10的上調基因和下調基因使用第二個數據集的pre-NAC的有應答組和無應答組的單細胞數據進行驗證（圖2C和2D）。
4.IPA揭示了有應答組和無應答組顯著差異的功能和通路
為進一步了解有應答組和無應答組富集的生物學通路，作者對上調基因進行IPA分析。在無應答組中富集程度最高的20條通路如圖3A所示，主要涉及細胞器發育和細胞功能通路，包括增殖，遷移和入侵，氧化磷酸化，糖酵解，糖異生和膽固醇生物合成等。而應答組中排名前20的下調通路主要參與樹突狀細胞成熟，T細胞信號通路，免疫應答和BAG2信號通路等（圖3B）。應答組中富集程度最高的功能主要為系統生長和細胞增殖（圖3C）。為進一步研究上游調控因子的下游功能，作者對無應答組中上調基因使用IPA進行分析。構建的網絡鑒定到7個上游調控因子，35個位于中間層次的基因（圖3D）。
5.有反應組的免疫浸潤細胞差異
使用IPA分析應答組的富集基因集，主要涉及免疫細胞轉運和細胞間信號相互作用（圖4A）。對pre-NAC和pre-NAC的應答組和無應答組的單細胞轉錄組數據進行分析，在應答組中CD19,CD8A,CD4,CD52,CD2,CD53,CD59,CD47,CD74和CXCL9的表達水平更高（圖4B）。在post-NAC的應答組中CD74+細胞的數量較多（圖4B）。為鑒定免疫滲透細胞在應答組和無應答組中是否存在功能差異，作者對CD45+EPCAM細胞的轉錄組進行IPA分析，結果表明應答組的免疫細胞功能較強，表明無應答組的免疫浸潤細胞功能受損（圖4C和4D）。
6.應答組和無應答組的基因與TNBC患者的生存的相關性
對應答組和無應答組進行差異分析鑒定到788個上調基因和244個下調基因（圖4）。對360例TNCB患者的轉錄組數據中應答組和無應答組的差異基因進行單因素生存分析，其中無應答組中的上調基因與RFS較差有關（圖5A），而應答組中的上調基因與預后較好有關（圖5B）。隨后，作者進行多因素Cox回歸分析，鑒定到3-基因模型（KIF5BhighHLA-ClowIGHG2low）可以準確預測RFS（圖5C）。3-基因模型的預測性能優于一些臨床特征，例如腫瘤大小，年齡，亞型和治療方式等（表1）。
7.靶向消除無應答組驅動基因會降低TNBC的形成和增強PTX敏感性
為研究驅動基因的機制和他們對PTX敏感性的作用，作者基于差異分析和通路分析選擇了10個基因進行進一步分析。使用782個應答組和535個無應答組的單細胞轉錄組數據驗證10個上調基因的表達水平（圖6A）。使用CCLE數據庫研究這10個基因在TNBC細胞系中的表達水平（圖6B）。在紫杉醇處理組和空白組中沉默BYSL和MYC會抑制TNBC的形成和增強PTX敏感性（圖6C-6E）。敲除FDPS,ENO1和PMVK會抑制TNBC的形成并增強PRX敏感性（圖6C-6F）。
結論：
本研究作者使用公共的TNBC的單細胞轉錄組數據進行分析構建了新輔助治療前后的單細胞轉錄組圖譜并鑒定與TNBC的NAC耐藥相關關鍵基因。此外，作者使用公共的TNBC的轉錄組數據進行分析鑒定到3-基因模型可以準確預測TNBC患者的RFS。本研究為今后的TNBC的靶向治療提供有價值的信息。
