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哈嘍，大家好，今天向大家分享的是近期發(fā)表在International Journal of Biological Sciences（IF：10.75）雜志上，縱觀全文，作者通過篩選基底膜（BM）相關的基因，并構(gòu)建了預后模型，無論在訓練集還是驗證集都得到了很好地結(jié)果，并通過實驗驗證了高基底膜基因評分（BMscore）可以促進腫瘤遷移。
Novel Implication of the Basement Membrane for Breast Cancer Outcome and Immune Infiltration
摘要
乳腺癌患者的治療失敗在很大程度上歸因于術(shù)后進展和治療抵抗。然而，一個有效的預后簽名識別這一人群是缺乏的。基底膜(BM)已被證實與癌癥的進展和轉(zhuǎn)移密切相關，并有可能成為乳腺癌強有力的預測因子。本研究從TCGA-BRCA、METABRIC和GSE96058轉(zhuǎn)錄組學、單細胞RNA轉(zhuǎn)錄組學和臨床信息，并進行Kaplan-Meier生存曲線、單細胞分析和體外實驗驗證模型標簽基因。
數(shù)據(jù)集：TCGA-BRCA訓練集和METABRIC、GSE96058兩個驗證集
關鍵詞：PFS:無進展生存期；DFS：無病生存期；DSS：疾病特異性生存期
1.基因的選擇和BMscore的構(gòu)建
將BM基因和三個數(shù)據(jù)集基因取交集得到203個BM基因（圖1A），對這些基因進行差異表達分析，在TCGA-BRCA 中77個差異表達（圖1B-C）。同時，篩選了體細胞突變最多的前20個BM基因(圖1D)。然后通過單變量分析篩選和OS最相關的12個BM基因用于后續(xù)分析（圖1E）。通過LASSO Cox回歸分析鑒定出6個關鍵的BM基因，包括LOXL1、FBLN1、FBLN5、SDC1、ADAMTS8和PXDNL(圖1F-G)。分別研究了這6個關鍵基因在TCGA-BCRA中的相關性、表達和預后，總結(jié)了6個BM基因的染色體位置和表達水平，交互作用網(wǎng)絡和相關性（圖1H-I）。
基于TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)和正常對照相比，乳腺癌中LOXL1、SDC1和PXDNL高表達，而FBLN1、FBLN5和ADAMTS8低表達，并通過RT-qPCR進一步驗證了6個BM基因的表達情況(圖2A-B)。每個基因在不同的乳腺癌分子亞型中表現(xiàn)出不同的表達水平。（乳腺癌分子亞型購自ATCC并按照相應規(guī)則培養(yǎng)）
TCGA-BRCA中的KM曲線顯示，PXDNL和SDC1高表達，BLN1、FBLN5、LOXL1和ADAMTS8低表達的患者生存更差。根據(jù)lasso的結(jié)果構(gòu)建BMscore公式：BMscore=SDC1的表達* 0.1625 + PXDNL的表達* 0.0942 - ADAMTS8的表達* 0.1399 - LOXL1的表達* 0.1176 - FBLN5的表達* 0.0328 - FBLN1的表達* 0.0189。
2.BMscore預測乳腺癌預后的有效性
為了驗證BMscore預測預后的有效性，作者分別將訓練集和測試集分成高低BMscore兩組（圖3A）。所有隊列中，高BMscore對應低的生存時間（圖3B-C），KM曲線顯示BMscore越高患者OS概率越低（圖3D）。因為BM可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，作者還對TCGA-BRCA的DFS、DSS和PFS進行了KM生存分析結(jié)果顯現(xiàn)，BMscore高的乳腺癌患者的死亡率顯著增加，這意味著更不利的DFS（圖3E-F）。
3.全面研究BMscore指標相關的基因
BMscore和乳腺癌生存相關，作者又分析了BMscore和臨床指標之間的相關性。對于這些臨床病理參數(shù)，在TCGA-BRCA中，BMscore與T stage、等級和分子亞型顯著相關；METABRIC隊列中，BMscore與陽性節(jié)點、等級和分子亞型顯著相關；GSE96058中，BMscore與陽性節(jié)點、腫瘤大小和分子亞型顯著相關（圖4A-D）。結(jié)果顯示，BMscore和臨床指標顯著相關，BMscore高的患者更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和嚴重的臨床分期。
療效對于乳腺癌的研究有著重要作用，作者研究了療效和BMscore之間的關系，在TCGA-BRCA隊列中，發(fā)現(xiàn)除了放療外，高BMscore和化療和內(nèi)分泌療法治療后較差生存相關（圖5A-C）。在METABRIC隊列中發(fā)現(xiàn)高BMscore的患者三種治療后預后更差（圖5D-F）。上述結(jié)果有效證明BMscore可以有效地預測乳腺癌患者的耐藥性。
4. 乳腺癌BMscore獨立預后價值的鑒定與評估
以上的結(jié)果證明了BMscore可以有效預測預后，作者又從多個角度進行了評估，除BMscore外，同時納入多個危險因素(年齡、T分期、N分期、M分期、PAM50亞型)，對TCGA-BRCA患者OS進行單因素和多因素Cox分析。單因素分析確定BMscore、分期、年齡、N期和M期為OS的獨立危險因素(圖6A)，在多因素分析中，年齡和BMscore仍然是OS的獨立預測因素(圖6B)。結(jié)合年齡和BMscore構(gòu)建箱線圖和DCA曲線用來預測OS (圖6C-E)。ROC曲線顯示了預測結(jié)果具有較高的準確性，特別是列線圖在三個隊列中預測效果都很準確（圖6F）。列線圖在預測TCGA-BRCA患者的生存預后方面具有良好的敏感性和特異性（圖6G-I）。這些結(jié)果都證明BMscore可以作為一個獨立的乳腺癌預后指標。
5. BMscore對乳腺癌免疫微環(huán)境的影響
腫瘤微環(huán)境在乳腺癌中起著關鍵作用，利用ESTIMATE評估評估腫瘤基質(zhì)評分、免疫評分和ESTIMATE評分，并分析BMscore和三者之間的關系，發(fā)現(xiàn)BMscore越高基質(zhì)評分越高（圖7A）。BM和免疫細胞都是腫瘤微環(huán)境中重要的組成部分，作者又使用CIBERSORT算法推斷了三個隊列中高低BMscore的免疫浸潤情況，發(fā)現(xiàn)在TCGA-BRCA BMscore高組中，M0巨噬細胞、M2巨噬細胞和靜息NK細胞顯著增加，而naive B細胞、靜息樹突狀細胞、靜息肥大細胞、單核細胞、活化NK細胞、靜息的CD4+記憶T細胞和CD8+ T細胞浸潤顯著增加(圖7B)。同時，還分析了BMscore與免疫檢查點和細胞因子表達的相關性，顯示BMscore高和免疫檢查點分子CTLA4、IDO1、ICOS和PVR高表達正相關(圖7C)。以上提示，BMscore高的患者可能對免疫檢查點阻斷治療，尤其是抗CTLA4治療更為敏感。在細胞因子方面， TNF、IL27和IL1B在高BMscore中高表達，而IL33和IL6相反（圖7D）。
作者又在單細胞數(shù)據(jù)中進行了分析，發(fā)現(xiàn)和其他細胞類型相比，BMscore在癌癥上皮細胞、腫瘤相關的成纖維細胞（CAFs）和漿母細胞中顯著差異（圖8A）。有利用桑基圖畫出乳腺癌亞型、患者和細胞占比的對應關系（圖8B）。發(fā)現(xiàn)不同細胞類型BMscore不同，但是癌癥細胞中BMscore更高（圖8C），并發(fā)現(xiàn)6個模型基因的表達情況與上述研究一致（圖8D）。由于CAF的BMscore差異顯著，進一步將CAF細胞進行分類，發(fā)現(xiàn)BMscore高的細胞大多被注釋為myCAF-like細胞，這種細胞最集中在乳腺腫瘤的侵襲性部位(圖8E)。為了研究上皮細胞異質(zhì)性和BMscore、模型基因之間的相關性，將腫瘤上皮細胞分為高循環(huán)組和低循環(huán)組，并顯示各組BMscore的分布和模型基因的表達（圖8F-G）。
6. BMscore與EMT活性呈正相關
BM缺失是導致惡性腫瘤的重要步驟，作者又研究了BMscore與EMT之間的相關性，功能富集結(jié)果顯示，高BMscore組富集的標志性通路包括根尖連接、凝血、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、糖酵解和mTORC1信號通路(圖9A)。高BMscore組顯著富集GO term包括表皮細胞分化、表皮發(fā)育、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、角化細胞分化和皮膚發(fā)育(圖9B)。高BMscore顯著富集的KEGG通路包括谷氨酸突觸、IL - 17信號通路、血小板活化、脂肪細胞脂解調(diào)節(jié)和金黃色葡萄球菌感染 (圖9C)。這些結(jié)果顯示BM在乳腺癌進展和轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。分析BMscore與EMT之間的相關性發(fā)現(xiàn)，EMT途徑與FBLN1、FBLN5、LOXL1、SDC1的表達存在很強的正相關(圖9D)。
結(jié)合功能注釋結(jié)果，作者假設BMscore與EMT正相關，為了驗證這一猜想，觀察了10個乳腺癌患者中6個模型基因的mRNA表達情況（圖10A）。計算這10個樣本的BMscore，并選擇最高和最低BMscore各三個樣本進行免疫組化染色，查看Ki-76的表達情況和EMT標記基因的表達情況（圖10B）。發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在高BMscore的組織中相對更豐富，這揭示了BMscore和EMT活性之間的強烈正相關關系，BMscore高的乳腺癌患者可能有更大的EMT介導的轉(zhuǎn)移風險。
7. SDC1在BMscore中起關鍵作用，同時也是乳腺癌的腫瘤啟動子
綜合以上結(jié)果，確定SDC1為與BMscore簽名相關的關鍵基因，并進行了體外實驗。siRNA介導的敲除，MDA-MB-231和MCF-7細胞中SDC1 mRNA水平降低(圖11A)。CCK8細胞增殖試驗顯示，SDC1減少的MDA-MB-231和MCF-7細胞株的生長均受到顯著抑制(圖11B)。從劃痕創(chuàng)面愈合(圖11C)和Transwell遷移試驗(圖11D)可以發(fā)現(xiàn)，降低SDC1誘導乳腺癌細胞的遷移抑制。此外，在siRNA轉(zhuǎn)染的細胞中檢測EMT標記物的蛋白水平，以驗證SDC1的改變是否導致了EMT標記基因的改變。如預期的那樣，SDC1沉默抑制了snail、slug、N-cadherin和ZEB1的蛋白表達，而E-cadherin相應增加(圖11E)。
小結(jié)
本文邏輯清晰，生信分析入手最后用濕實驗驗證模型基因。本文對乳腺癌的研究，從BM相關基因出發(fā)，構(gòu)建BMscore預測乳腺癌患者的生存。從多個角度驗證了高低BMscore患者的異質(zhì)性，從免疫浸潤、臨床指標、腫瘤分期等等，又分析了BMscore和EMT之間的相關性，BMscore可以有效的預測腫瘤的轉(zhuǎn)移。本篇文章從模型基因的篩選以及模型構(gòu)建和評估，在訓練集和驗證集都得到了很好的結(jié)果。首先BM相關基因的篩選是從訓練集合驗證集交疊基因取得，所以在后續(xù)進行驗證時不會出現(xiàn)模型基因在驗證基因沒有表達的情況。作者在設計試驗和分析方法上都是值得我們學習的！
