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組織及單細胞測序相結合的研究思路在腫瘤研究中越來越受到關注，那么其在非腫瘤疾病中如何應用呢？小編今天就給大家分享一篇今年2月發表在BMC BIOLOGY（IF:7.364）雜志上結合組織及單細胞數據研究動脈粥樣硬化免疫微環境并識別治療靶點的文章。

Bulk and single-cell characterisation of the immune heterogeneity of atherosclerosis identifes novel targets for immunotherapy

基于動脈粥樣硬化免疫異質性的組織和單細胞特征識別免疫治療新靶點

一．研究背景

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis)是由內膜下含膽固醇的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)顆粒累積形成含有脂質、結締組織和免疫細胞的斑塊引起的慢性炎癥性疾病，也是導致心血管疾病的主要原因。研究已經發現免疫細胞浸潤病變對動脈粥樣硬化進展至關重要，也是影響免疫治療的主要原因。因此該文章通過整合多個樣本的組織及單細胞測序數據，研究動脈粥樣硬化的免疫異質性并識別了新的治療靶點。

二．文章摘要

研究從公共數據庫獲取了動脈粥樣硬化病變的組織及單細胞測序數據，首先根據單細胞表達數據識別出28個細胞亞群，接著發現這些細胞在組織偏好、遺傳擾動、免疫動力學、轉錄調控因子、代謝變化和通信模式等水平上具有高度異質性。其中，干擾素誘導的CD8⁺T細胞參與了動脈粥樣硬化的進程，而促炎CD4⁺ CD28^null T細胞則與動脈粥樣硬化的不良結局有關。進一步研究也識別了兩個具有不同表型的泡沫巨噬細胞亞群。此外，研究通過組織數據的去卷積分析發現破裂和出血病變中功能失調細胞的比例更高，且與動脈粥樣硬化不良預后顯著相關。

三．文章的主要內容及結果

1. 整合scRNA - seq數據識別動脈粥樣硬化病變中主要的細胞亞群

文章第一部分整合單細胞數據分析了人類動脈粥樣硬化病變中的細胞多樣性。研究納入了三個來自公共數據庫的scRNA-seq數據集(圖1a)，整合質控后保留了44120個免疫細胞，接著根據標志基因，將這些細胞聚類注釋為T細胞、髓系細胞、B細胞、固有淋巴樣細胞(ILCs)、肥大細胞和漿細胞(圖1b, c)。研究發現B細胞和肥大細胞純度較高，而髓系細胞和漿細胞的異質性更強(圖1d)。此外，研究基于Ro/e分析對這些細胞亞群進行了組織富集分析，結果觀察到肥大細胞和髓系細胞優先分布在動脈粥樣硬化核心(AC)部位，而淋巴細胞優先分布在鄰近部位(PA)(圖1e)。接著研究對AC和PA之間的免疫細胞進行分析發現與PA樣本相比AC樣本的肥大細胞和髓系細胞與缺氧相關(圖1f)。

2. 動脈粥樣硬化斑塊中T細胞和ILC細胞的分離和聚類

這一部分研究對動脈粥樣硬化病變中T細胞和ILC細胞的譜系和特征進行了分析。研究先將24183個T細胞和ILC細胞聚成13個亞群，并注釋為4個CD4⁺ T細胞亞群、6個CD8⁺ T細胞亞群和3個ILC亞群(圖2a-c)。接著研究根據Ro/e指數，發現CD8-C5-GZMB T細胞主要分布在PA中，而CD8-C3-IFI44L和CD8-C6-TOP2A T細胞則相反(圖2d)。此外，研究也觀察到CD8-C3-IFI44L T細胞的浸潤隨著疾病進展而增加(圖2e)，這些細胞中IFN誘導基因表達也較高且富集到IFN相關通路(圖2f, g)。研究也發現CD8-C6-TOP2A T細胞同時表達了增殖，毒性和耗竭相關基因，并且優先分布在AC中(圖2b)。

3. 軌跡分析揭示致病性活化的CD4⁺T細胞亞群

這一部分作者對CD4⁺和CD8⁺ T細胞進行了偽時序分析。作者根據動脈粥樣硬化斑塊中T細胞的發育軌跡推斷T細胞的譜系結構，發現CD4-C1-SELL T細胞位于與CD4-C4-GZMA T細胞相反的一端，而CD4-C2-CXCR5 T和CD4-C3-FOXP3 T細胞主要位于中心(圖3a)。由于CD4-C4-GZMA細胞分化為兩個不同的分支（細胞命運1及細胞命運2），作者為了研究這種異質性的潛在機制對命運1細胞和命運2細胞進行了富集分析(圖3b)，并分析了命運2細胞的組織分布，結果觀察到其在晚期斑塊中比例較高(圖3c)，此外生存分析顯示，這些細胞與動脈粥樣硬化的不良預后顯著相關(圖3c)。接著作者預測了命運2細胞中上調基因的轉錄調控因子，并利用Cytoscape構建了調控網絡(圖3d)，結果觀察到偽時序進程中炎癥調控因子顯著上調(圖3e)。總之，這些結果表明，這些促炎活化T細胞的存在可能驅動動脈粥樣硬化病變的進展。

4. 動脈粥樣硬化病變中髓系細胞的分離和聚類

這一部分研究對髓系細胞進行了譜系和特征分析。作者首先將13963個髓系細胞重聚為14個亞群，分別為DC-C1-CLEC9A (cDC1s)、DC-C2-CD1C (cDC2s)、DC-C3-FSCN1(成熟DC)、DC-C4-IL3RA (pDC)、Mono-C1-CD14(經典型單核細胞)、MonoC2-CD14-CD16(中間單核細胞)和MonoC3-CD16(非經典型單核細胞)細胞，以及7個不同的巨噬細胞亞群(圖4a)。接著作者根據標記基因的表達和功能特征識別了動脈粥樣硬化浸潤髓系細胞亞群特征(圖4b、c)。此外，作者基于Ro/e指數觀察到HLA-DR和互補基因低表達的細胞優先分布在AC中(圖4b, d)。研究進一步比較單核細胞亞群，發現中間型單核細胞最多，經典型單核細胞最少，這些亞群都主要分布在PA中(圖4a, d)，功能分析發現經典單核細胞主要富集于趨化和遷移相關通路，而非經典單核細胞表現為促炎表型(圖4e)。作者在7個巨噬細胞亞群中發現C1對應于IFINC巨噬細胞；C2、C3對應炎性巨噬細胞；C4對應巨噬細胞；C5亞群表達促纖維化標志物； C6和C7表達泡沫細胞相關基因(圖4f)。接著Ro/e分析發現炎性和常駐巨噬細胞主要在PA中，而泡沫狀巨噬細胞主要在AC中(圖4d)。

5. 功能失調的泡沫巨噬細胞及其潛在調控關系的識別

這一部分研究對兩種泡沫巨噬細胞進行了刻畫。研究首先分析了兩種泡沫巨噬細胞中TREM2介導的功能，結果觀察到脂蛋白顆粒清除及膽固醇酯化等調節通路在TREM2⁺C6泡沫巨噬細胞中顯著上調(圖5a)，而SPP1⁺巨噬細胞中與溶酶體和膽固醇酯化相關的評分顯著降低(圖5b)。此外，研究也發現與TREM2⁺巨噬細胞相比，SPP1⁺細胞顯示出顯著較高的內質網應激、凋亡和自噬及血管生成評分(圖5b)。研究也在晚期動脈粥樣硬化和斑塊內出血病變中檢測到SPP1⁺巨噬細胞浸潤(圖5c)。接下來研究對單核細胞和巨噬細胞進行了偽時序分析，觀察到軌跡起源于單核細胞，并分成不同的發育軌跡，中間單核細胞連接到SPP1⁺泡沫巨噬細胞，并富集了脂質和膽固醇代謝通路(圖4e)。通路富集分析也顯示代謝通路在具有不同分化命運的細胞中顯著富集(圖5d)。研究接下來使用SCENIC分析了SPP1⁺泡沫巨噬細胞的調控序列，其中包括SOX13, PAX8，THAP11，PPARG和CEBPE調控(圖5e)。隨后，研究使用NicheNet分析研究了SPP1⁺泡沫巨噬細胞的外部調節因子，結果發現CSF1可能作為配體驅動SPP1⁺泡沫巨噬細胞(圖5f)。此外，CellphoneDB結果也表明肥大細胞更可能與SPP1⁺泡沫巨噬細胞相互作用(圖5g)。此外，研究在組織數據中也發現CSF1在動脈粥樣硬化斑塊進展過程中表達顯著增加(圖5h)，且在動脈粥樣硬化病變中肥大細胞和SPP1⁺泡沫巨噬細胞的比例也正相關(圖5i)。

6. 巨噬細胞在內的細胞類型特異的代謝程序

這一部分研究對細胞類型特異的代謝程序進行了介紹。研究首先使用scMetabolism計算了77條代謝通路的活性評分，發現髓系細胞在AC和PA的代謝評分均最高(圖6a)。接下來研究根據代謝評分對巨噬細胞進行排序(圖6b)，結果發現TREM2⁺泡沫巨噬細胞的代謝活性最大，而SPP1⁺泡沫巨噬細胞的代謝活性相對較低(圖6b)。對兩個亞群之間代謝通路的進一步分析也發現25條代謝通路在SPP1⁺泡沫巨噬細胞中上調，52條代謝通路在TREM2⁺泡沫巨噬細胞中上調(圖6c)。此外，研究觀察到SPP1⁺泡沫巨噬細胞中缺氧評分最高(圖6d)，研究也發現缺氧與糖酵解顯著相關，而線粒體程序則相反(圖6e)。為了證明代謝重編程和巨噬細胞表型改變之間的聯系，研究進一步分析了25條上調的代謝通路與SPP1⁺泡沫巨噬細胞表型評分之間的關系，結果發現巨噬細胞特異性代謝過程與自噬、凋亡和內質網應激相關(圖6f)。接著對SPP1⁺泡沫巨噬細胞中上調的代謝和標記基因進行的分析表明，MIF和FBP1是潛在的代謝調節靶點(圖6g)。

7. 浸潤性免疫細胞之間的細胞間通訊以及免疫細胞特征和患者生存之間的相關性

文章最后一部分對免疫細胞間的通訊及與患者預后之間的關聯進行了介紹。研究首先利用CellChat構建了細胞間的通訊網絡，觀察到PA區域比AC區域具有更多的細胞間相互作用(圖7a, b)。接著研究觀察了髓系亞群之間的細胞通信，識別了在AC或PA中富集的23條信號通路(圖7c)，并進一步觀察了SPP1⁺泡沫巨噬細胞與所有巨噬細胞亞群的相互作用(圖7d, e)。此外，研究還對重要通路的信號及受體水平變化進行了詳細分析(圖7f)。最后研究使用了一個更大的隊列，評估了每個巨噬細胞亞群和患者人群的風險比，結果發現TREM2⁺泡沫巨噬細胞水平與較好的疾病預后相關(圖7g)，而較高豐度的SPP1⁺泡沫巨噬細胞與較差的預后顯著相關(圖7g)。

到這里這篇文章的主要內容就介紹完了，文章結合了組織及單細胞數據，對動脈粥樣硬化的免疫異質性進行了全面的刻畫，并識別出了潛在的免疫治療靶點。文章使用差異分析，富集分析及偽時序分析等方法從多個角度分析了動脈粥樣硬化病變中免疫浸潤的特征，內容豐富，邏輯清晰，值得小伙伴們參考學習。