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癌細胞耐藥性和可塑性是導致癌癥治療失敗的主要原因，而研究治療過程中腫瘤內細胞亞群的進化對解析癌癥耐藥性及可塑性至關重要。因此，小編今天和大家分享一篇今年10月剛剛發表在Genome Medicine（IF：15.266）雜志上關于細胞進化與耐藥的文章。文章提出了一種新的策略，可以根據患者特異性腫瘤亞群在放療（RT）或細胞毒性治療時發生的變化來設計癌癥治療。文章聚焦腫瘤內細胞進化與耐藥性的關聯，邏輯清晰，角度新穎，有理有據，很具有參考及啟發意義。
Computational quantifcation and characterization of independently evolving cellular subpopulations within tumors is critical to inhibit anti-cancer therapy resistance
定量及刻畫腫瘤內獨立進化的細胞亞群對抑制抗癌治療耐藥性至關重要
一．研究背景
目前耐藥性是限制抗癌療法效果的主要因素，引起癌癥耐藥的一個主要原因是癌癥的可塑性，即一種癌癥亞型會根據治療的不同而轉變為另一種癌癥亞型，例如，三陰性乳腺癌（TNBC）在治療過程中可能會轉變為Her2陽性乳腺癌。此外，腫瘤診斷的準確性和后續治療的決策對治療效果至關重要。因此，該研究評估了一種新的方法來刻畫治療誘導的腫瘤細胞亞群進化，并對癌癥治療耐藥的機制進行了解析。
二．文章摘要
該研究基于信息論開發了一種能夠探索腫瘤組成的單細胞量化策略，且該策略有助于抗癌療法的高分辨率及個性化評估。該單細胞量化策略首先構建每個細胞的特異性信號特征（CSSS），然后基于CSSS計算細胞的條碼（barcodes）。最后使用基于CSSS的barcodes揭示腫瘤內為響應外部影響而產生的進化，并據此進一步為腫瘤分配靶向藥物來優化腫瘤治療。此外，研究也通過TNBC模型和放療中存在表型切換的患者對研究結果進行了驗證。
三．研究的主要內容及結果
1. 研究的總體流程
文章首先對研究的總體流程進行了介紹，該研究主要分為4部分：1）首先是通過文獻檢索確定了能夠用于單細胞定量和分析的乳腺癌細胞表面標記物。2）接著使用靶向細胞表面癌蛋白的熒光標記抗體對單細胞懸液進行標記，并檢測每個細胞的癌蛋白的表達水平（圖1A）。3）接著應用單細胞驚異分析（Surprisal analysis；SA）來識別每個細胞的特異性信號特征（CSSS），進而識別腫瘤內不同的細胞亞型（圖1B）。4）最后進行了一系列體外和體內實驗對研究結果進行驗證（圖1C）。
2. CSSS分析
這一部分作者對CSSS分析過程進行了詳細介紹。研究首先對乳腺癌相關的癌標志物進行文獻搜索并選擇了11個細胞表面蛋白進行單細胞量化。這11個標志物為Her2、EGFR、EpCAM、CD44、CD24、PD-L1、cKit、CD133、E-Cadherin、cMet和MUC1。其中EGFR, Her2, MUC1,cMet和cKit與侵襲性表型的乳腺癌增殖相關；EpCAM, E-Cadherin, CD133, MUC1,cMet和cKit則與癌癥轉移和侵襲相關；而CD44, CD24, CD133與干細胞特性相關；PD-L1則與免疫應答有關；此外，Her2, cMet, EGFR, MUC1, cKit, PD-L1也是乳腺癌治療的潛在藥物靶點。接下來，研究使用多色流式細胞熒光分選（FACS）方法對單細胞中的這11個標志物進行定量（圖2A），并據此對單細胞進行SA分析（圖2B，C）。接著研究保留細胞具有顯著振幅的過程，進而識別了細胞特異性過程，并稱之為“細胞特異性信號特征”（CSSS）（圖2D）。此外，研究為了簡化將每個CSSS轉換為細胞特定的條碼，圖形化地表示細胞中的一組活動過程（圖2D）。接下來，研究基于細胞匹配的CSSS識別了不同的亞群（圖2E），并研究了CSSS與治療策略的關聯（圖2F）。
3. 在4T1小鼠的TNBC細胞中10個不平衡過程會引起11種細胞表面蛋白的表達變化
這一部分研究使用TNBC模型對不平衡過程與細胞表面蛋白的關聯進行了介紹。研究中使用的第一個TNBC模型中包括4T1細胞，該細胞來源于小鼠的乳腺腫瘤代表IV期的TNBC。研究發現Her2和cMet表達水平（圖3A）以及其他標記物會在放療（RT）的作用下發生改變，不過cMet和Her2的表達相關性不顯著（圖3B），相反地EGFR和Her2及MUC1和cMet則表現出很強的相關性（圖3C，D）。接下來為了探索所有可能的蛋白與蛋白之間的關系，研究進行了單細胞SA分析，該方法可以識別和定位在整個細胞群和每個細胞中發生的不平衡過程，結果在細胞群中識別了10個不平衡過程，作者展示了4個出現在大于1%的細胞中的過程（圖3F）。其中過程3和8包括Her2和EGFR及cMet和MUC1的誘導（圖3F）。
4. 在RT反應中觀察到Her+和cMet+亞群的擴張
由于每個細胞中可能存在多個不平衡過程，因此這一部分作者對每個細胞的CSSS進行分析，并揭示了基于CSSS的細胞亞群。研究首先在RT前后的細胞群中發現了8個優勢亞群，并將每個亞群進行編碼（圖3G）。接下來研究分析了放療時間與優勢亞群的關聯，結果發現亞群c在放療6天后下降。然而，亞群b和f在放療6天后顯著增加（圖4A）。其中，亞群b中只存Her2和EGFR誘導相關的過程3，而亞群f中只存在cMet和MUC1誘導相關的過程8（圖4A）。這種在放療后的Her2+和cMet+亞群的擴張表明，Her2和cMet信號通路可能在4T1細胞的生存和對RT的抵抗中發揮重要作用。接下來，為了刻畫擴張的Her2+和cMet+亞群在RT反應中的增殖特性，研究使用免疫熒光法將4T1細胞群與抗ki67（增殖生物標志物）、抗cMet和Her2抗體聯合染色。結果在存活的RT細胞中觀察到Ki67、Her2和cMet的表達顯著增加（圖4B、C、E和F）。此外，Her2和Ki67蛋白以及cMet和Ki67蛋白也協同增強（圖4D，E）。
5. 同時抑制Her2和cMet可致敏4T1 TNBC模型的RT治療
這一部分，作者對Her2和cMet抑制與4T1 TNBC模型的RT治療敏感性的關聯進行了分析。研究從放療前3天開始直到放療后6天，單獨或聯合抑制每種蛋白質，之后測量細胞存活率。結果發現Her2抑制劑和cMet抑制劑在使細胞對RT敏感方面顯示出協同效應（圖4H）。這兩種抑制劑與RT的聯合使用增加了細胞死亡，并減少了下游對Her2和cMet的信號傳導（圖4I）。為了進一步驗證這一結果，作者將4T1細胞植入小鼠，并對腫瘤采用放療（圖5A），接著切除4T1腫瘤對單細胞懸液進行分析，結果觀察到腫瘤在放療初始收縮（圖5B），后續則發生亞群b和f的擴張（圖5C）。此外，在放療后12天腫瘤恢復生長時（圖5B），這些擴張的亞群仍然能夠被檢測到（圖5C）。此外，研究也觀察到抑制Her2和cMet蛋白（5D）會顯著使腫瘤對放療敏感（圖5E），且聯合治療會導致腫瘤縮小，并阻止RT耐藥的發展（圖5E）。此外，在RT之前加入靶向藥物組合，也會使b和f亞群的大小顯著減少（圖5F）。
6. 靶向Her2和cMet使人細胞系和患者源性TNBC對RT敏感
這一部分為了進一步驗證Her2+和cMet+細胞亞群的擴張與TNBC的關聯，研究納入了TNBC人源性細胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468以及TNBC患者源性細胞（BR45）進行了驗證。結果在放療后6天，觀察到所有類型的細胞生長受到抑制，隨后在放療后14天出現顯著的細胞再生（圖6A）。而且在所有細胞類型中，b和f亞群在放療后6天擴張，在放療14天后要么保持其大小，要么擴張（圖6B）。接下來，研究發現抗Her2和抗Met的聯合預處理能夠使3種類型的人TNBC細胞對RT敏感（圖6C）。此外，與兩種藥物與RT聯合使用相比，每一種藥物單獨對細胞存活的影響明顯較小（圖6C）。進一步當細胞被抗Her2和抗cMet預處理時，研究觀察到下游的Her2和cMet信號通路損耗（圖6D）。接下來，研究使用患者源性TNBC BR45細胞，證明了放療的BR45 TNBC會在短時間內對放療產生耐藥性（圖6E）。接著研究在放療前單獨用每種藥物對小鼠進行預處理，結果發現腫瘤生長在一定程度上被抑制（圖6E）。然而，作者聯合使用這兩種藥物對小鼠的處理時，則觀察到它們展示出與放療顯著的協同效應，腫瘤顯著縮小且耐藥的發展也受到抑制（圖6E）。此外，當靶向聯合藥物在放療前應用時，b和f亞群也減少（圖6F）。
到這里這篇文章的主要內容就介紹完了，文章開發了一種在單細胞水平探索腫瘤內部進化異質性的方法，并以乳腺癌為例探索了治療誘導的腫瘤進化與耐藥性的關聯，同時對實驗結果進行了體內及體外實驗驗證。文章內容豐富，干濕結合，有理有據，對外部影響誘導的腫瘤進化進行了詳細刻畫，文章將腫瘤進化與耐藥聯合分析的研究思路值得我們參考。
