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在組成細胞的生物分子中，脂質通常比蛋白質和核酸受到更少的關注。有研究證明脂質代謝的改變與癌癥的發展和進展有關。今天小編給大家介紹一篇2023年3月發表在BMC cancer（IF:4.638）上一篇名為OSBPL家族基因在肝癌中的表達、免疫浸潤、預后及實驗驗證的文章，文章充分利用了公共數據庫的資源，邏輯清晰，實驗完整，下面讓我們詳細的看一下吧。
一、背景
脂質（Lipids）具有豐富多樣的生物學功能，既能作為儲能物質，又能充當信號分子，還是細胞膜結構的關鍵成分。有研究發現脂質代謝的改變與癌癥的發展和進展有關。腫瘤微環境中營養物質的可用性不斷變化，癌細胞利用脂質代謝獲取癌細胞增殖、存活、侵襲、轉移以及對腫瘤微環境和癌癥治療響應所需要的能量、生物膜成分和所需的信號分子。
氧固醇結合蛋白樣（OSBPL）家族是真核生物中脂質結合/轉移蛋白（LTP）的最大家族之一，參與脂質結合和轉運，OSBPL家族位于細胞膜上，在細胞器之間交換分子或信號，并作為的必要轉運蛋白，在腫瘤發生中起關鍵作用。OSBPL蛋白家族包括9個成員，分別是OSBPL2、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL6、OSBPL7、OSBPL8、OSBPL9、OSBPL10和OSBPL11。本文作者將目光投向了OSBPL家族，探究其在肝癌的基因表達、免疫浸潤和預后等方面的影響。
二、主要思路
圖1 本實驗設計流程圖
本文通過分析RNA-seq數據和CPTAC的蛋白質數據，分別評估肝臟腫瘤和正常組織中OSBPLs的表達差異。隨后對遺傳變異、潛在功能富集分析和免疫細胞浸潤進行分析。此外，通過構建LASSO模型和進行受試者工作特征曲線(ROC)分析，確定OSBPLs的預后影響。并選取10例局部肝癌標本，通過免疫組化(IHC)方法驗證OSBPL3的表達。最后通過CCK-8、細胞周期、凋亡、RT-qPCR、蛋白印跡等方法探討OSBPL3在肝癌細胞中的功能。
三、主要結果
1. 肝癌組織中OSBPLs的mRNA和蛋白表達
本文通過分析TCGA數據中肝臟腫瘤和與其匹配的正常組織(50對)中OSBPLs的mRNA表達，發現OSBPL2、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL7、OSBPL8和OSBPL9均上調(圖2a)。為了進一步證實它們在更大隊列中的表達，本文使用了160例正常腫瘤和371例TCGA和GTEx腫瘤樣本，發現OSBPL2、OSBPL3、OSBPL8在肝臟腫瘤中過表達，而OSBPL6在肝臟腫瘤中下調(圖2b)。
利用CPTAC數據庫檢測肝臟腫瘤組織和正常組織中OSBPLs的蛋白表達，發現腫瘤樣本中OSBPL2、OSBPL3蛋白表達升高，而OSBPL5、OSBPL6、OSBPL9、OSBPL10、OSBPL11蛋白表達低(圖2c)。
綜上所述，本文認為OSBPL2、OSBPL3和OSBPL6可能與肝癌的進展有關。
圖2 OSBPLs在肝臟腫瘤組織和正常組織中的mRNA和蛋白表達
2. 肝癌組織中CNV、甲基化與OSBPLs mRNA表達的關系
接下來本文使用了GSCA在線數據庫，該數據庫匯集了包括CNV、突變、甲基化和免疫在內的各種腫瘤基因組數據，用于評估OSBPLs的CNV和甲基化水平。
對肝癌組織進行了拷貝數變異（CNV）分析，發現OSBPL2、OSBPL3和OSBPL7的CNV均以擴增為主。而OSBPL5和OSBPL9的CNV主要是缺失(圖3a)。OSBPL2、OSBPL8、OSBPL9、OSBPL11的表達與CNV呈正相關(圖3b)。隨后本文評估了DNA甲基化與OSBPLs表達之間的關系。發現甲基化水平與OSBPLs的表達總體呈現負相關(圖3c)。計算腫瘤DNA甲基化與正常DNA甲基化的差異。本文發現肝臟腫瘤中OSBPL3和OSBOL9的DNA甲基化表達明顯低于正常組織，而OSBPL5和OSBPL7的DNA甲基化表達明顯高于正常組織(圖3d)。
以上結果表明，CNV擴增主要導致OSBPL2的過表達，而DNA甲基化可能導致OSBPL3的高表達。
圖3 肝癌組織中OSBPLs的CNV和DNA甲基化差異
3. 肝癌組織中OSBPLs表達與免疫浸潤的關系
作者通過TIMER數據庫確定OSBPLs表達與免疫浸潤之間的相關性。作者在這里使用了StromalScore、ImmuneScore和EstimateScore三種不同的策略計算OSBPLs的免疫評分，結果顯示OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7和OSBPL10與免疫浸潤顯著正相關(圖4a)。隨后，作者還評估了OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7、OSBPL10的表達與不同免疫細胞類型浸潤的關系。結果顯示，OSBPL3、OSBPL5、SOBPL7、OSBPL10的表達與腫瘤純度、B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤水平顯著相關(圖4b)。
圖4 OSBPLs表達與免疫浸潤的相關性
4. 生存模型構建與分析
作者為了評估基因表達對總生存率（OS）的貢獻，將OSBPLs成員輸入LASSO回歸模型，生成兩個關鍵基因OSBPL3和OSBPL10(圖5a-b)。根據風險評分將肝癌患者分為高組和低組，發現高組患者的生存期明顯短于低組(圖5c)。此外，作者還構建了LASSO回歸模型來評估基因表達對疾病特異性生存期（DSS）的影響，其中OSBPL3和OSBPL6是兩個關鍵候選基因(圖5d-e)。患者也被分為高、低風險評分組，與低風險組相比，高風險組DSS較差(圖5f)。
在這兩個LASSO模型中，OSBPL3是唯一與OS和DSS都相關的基因，表明OSBPL3是肝癌的預后因素。
圖5 OSBPLs相關風險評分構建。
5. OSBPL3在肝癌中的表達驗證
作者進行了ROC分析，評估OSBPL3對肝癌的診斷效力，結果顯示OSBPL3是一個較強的預測因子(AUC=0.921, CI= 0.883-0.959)(圖6a)。基于以上所有結果，作者發現OSBPL3在肝癌中過表達且與預后相關，假設OSBPL3可能在肝癌的發展中發揮關鍵作用。為了驗證這一猜想，作者分析了4組GEO數據集進行OSBPL3在肝癌中的表達驗證，結果顯示腫瘤樣本中OSBPL3 mRNA顯著升高(圖6b)。
接下來作者通過免疫組化實驗驗證OSBPL3的表達，共使用10例與正常相鄰組織相匹配的肝癌樣本，發現OSBPL3蛋白在10個局部肝臟腫瘤樣本中也有高表達(圖6c)。
圖6 OSBPL3在肝癌中的表達驗證
6. OSBPL3在肝癌組織中的GSEA分析
為了更好地了解OSBPL3在肝癌發生中的潛在機制，作者利用RNA-seq數據進行基因表達相關性分析和差異表達基因(DEGs)分析。共鑒定出4441個DEG和2986個與OSBPL3相關的基因(圖7a-b)。為了進一步鑒定OSBPL3的功能相關基因，作者將上調的DEGs與正相關基因進行交叉，得到353個交叉基因(圖7c)。隨后對這353個基因進行GSEA分析，結果顯示細胞周期和細胞外基質組織通路明顯富集(圖7d)。
圖7 OSBPL3功能相關基因的GESA分析
7. OSBPL3在肝癌細胞中的功能分析
細胞周期失調和細胞外基質重塑是其重要特征。鑒于GSEA的數據，作者試圖確定OSBPL3在細胞增殖和遷移調節中的作用。首先在肝癌細胞系中檢測OSBPL3的mRNA表達，結果顯示，與其他5種肝癌細胞系相比，OSBPL3在PLC/PRF/5中高表達(圖8a)。因此，作者選擇了PLC/ PRF/5進行進一步的實驗。最終發現敲除OSBPL3可顯著抑制細胞增殖，并誘導G2/M細胞周期阻滯(圖8b-c)。干擾OSBPL3也促進了明顯的凋亡(圖8d)。在OSBPL3 siRNA處理后，促凋亡蛋白包括Bax、PARP和cleaved caspase-3被激活(圖8e)。此外，轉染OSBPL3 siRNA后，細胞遷移明顯受阻(圖8f)。
圖8 敲除OSBPL3抑制細胞增殖和遷移
四、小結
總之，作者評估了肝癌的表達、基因組和表觀基因組變異。本文分析思路清晰，邏輯縝密，用簡單的生物信息學方法闡述了OSBPL家族在肝癌中的主要表達方式，免疫浸潤模式以及找到了一個重要OSBPL家族成員OSBPL3作為重要的預后特征，并分別使用其他數據庫數據及免疫組化實驗對其進行了驗證，最后通過結合功能富集和基因敲除實驗確定了下調OSBPL3可誘導G2/M細胞周期阻滯和凋亡，抑制細胞遷移。
