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唾液也可以檢測疾?。颗R床試驗的又一新思路
作者：劉 一 一
唾液檢測是一種近年興起的、研究比較熱門的醫學檢查方法。唾液作為人體重要的排泄途徑之一，是由血液中的水、鹽和大量分子與口腔中的唾液蛋白等混合而成。血液中的許多成分通過胞內或胞外途徑進入唾液，使得血液中可以檢測的大多數化合物也存在于唾液中，因此，從這個意義上來說，唾液相較于尿液、血液、糞便、腦脊液等來說，其作為一種安全創傷、取材便捷、無血源性疾病傳播的危險、無痛苦和易于接受的生物液體，蘊含著大量的生物信息，能夠了解機體的健康與疾病狀態。近年來，學者們的研究已經發現，使用唾液樣本可以檢測除口腔疾病和唾液腺疾病之外的其他系統性疾病，包括糖尿病、心血管疾病、感染性疾病、神經退行性疾病和腫瘤等。
因此，今天將和大家分享的是一篇發表在《Movement Disorders》上的“Salivary microR-153 and microR-223 Levels as Potential Diagnostic Biomarkers of Idiopathic Parkinson’s Disease”文章，2021年實時影響因子為10.338。通過學習完本篇文章，希望各位讀者能夠參考借鑒本篇文章，以發掘臨床試驗的新思路。
在我國，帕金森病(Parkinson's disease, PD)的患者數量已超過300萬，位居世界第一，帕金森及相關的神經退行性疾病已成為繼腫瘤、心腦血管病之后中老年人的“第三殺手”。世界衛生組織專家預測，2030年的中國帕金森病患者將達到500萬，如此龐大的患者數量，無疑給社會和國家醫療帶來了巨大的負擔。PD起病緩慢且隱匿，往往是大腦中與疾病相關的病理改變已經出現，但常規影像學檢查卻無明顯表現。當患者被確診時，病情大多已經是中晚期，這導致絕大多數 PD 患者錯失了早期治療的最佳時機。既往的研究已經發現，在過去的25年里，PD診斷的準確性僅為80%，尤其是早期PD (Hoehn和Yahr[H&Y]階段1)特別容易誤診，因此，能夠早期診斷PD對疾病的治療和預后都影響重大。
唾液具有無創獲取、方便取用、成本廉價等多種優勢，并能最大限度地減少類似于采集腦脊液、血液等時給患者帶來的緊張、害怕等情緒壓力，非常適合輔助神經系統疾病的早期診斷，尤其適用于多次采樣以評估治療效果。但唾液檢測也存在一個很大的劣勢，即尚缺乏特異性的、標準化的方法。
作者通過收集83名PD患者和77名無神經系統疾病的實驗對照組，采集唾液并提取RNA，采用RT-PCR方法檢測miR-153和miR-223水平，以探索唾液中存在的miRNA將有可能成為PD的主要生物標記物并應用于臨床。
第一步，確定待檢測生物標志物。作者通過TargetScan數據庫預測α突出核蛋白（α-synuclein）的調控miRNA，并綜合前期的研究分析，確定了本實驗的待檢測miRNA，即miR-153和miR-223。
Tips：
1） miRNA靶基因預測數據庫。 TargetScan是一款預測miRNA結合位點的軟件，對于哺乳動物中miRNA結合位點預測的效果非常好。除了TargetScan數據庫以外，miRNA靶基因預測數據庫還有MiRWalk，miRMAp，miRBase、miRDB等等，想要了解更多上述數據庫的信息，可以關注生信人的公眾號哦，在上面可以找到更詳細的功能介紹。
2）待檢測生物標志物的選擇。非編碼RNA近年來一直是各學者們的研究熱點，本篇文章選用的是miRNA，但非編碼RNA是一個很龐大的家族，還包括cirRNA、lncRNA等，讀者們后期可變換一下待預測分子的選擇，如阿爾茲海默癥的β淀粉樣蛋白Aβ、tau蛋白等，通過數據庫預測靶向調控的非編碼RNA，參照本課題的套路就又可以復刻出很多篇臨床試驗文章了呢。關于circRNA靶基因預測數據庫（Circular RNA Interactome），lncRNA靶基因預測數據庫（LncRNA2 target，Starbase等），更詳細的數據庫介紹同樣可以在本公眾號中找到哦。
第二步，唾液采集和處理。 由于目前唾液檢測尚缺乏特異性的、標準化的方法，唾液取材也是一個比較大的挑戰。本文的唾液采集和處理方法如下，讀者們可以參考。采集時間：進食食物或液體后至少間隔30分鐘。采集方法：被動流口水法。處理：4℃條件下最多保存3h。隨后在4℃，10,000rpm條件下，離心20min以去除食物顆粒，降低樣品粘度，后提取上清液保存在-80℃條件下。
Tips：
1） 唾液穩定性。在本篇文章中，作者已經明確了唾液在實驗條件下存放具有很高的穩定性，并不會影響樣本，作者探討了其在長達4年的儲存時間下，也不會對唾液產生顯著影響（P = 0.3）。 也正是其具備很高的穩定性，其作為疾病生物標志物的研究潛力就顯得更大了。
2）樣本采集時唾液含量可能受晝夜節律和時間的影響。唾液雖然易于獲取，但唾液的分泌受口腔狀況、晝夜節律和時間的影響，導致分泌量和組分發生改變，所以為了最大可能的減少樣本間的差異，建議讀者們后續實驗采集的時候注意固定采集時間。
3）采集病人的依從性。帕金森病常會表現出唾液分泌過多或口干等癥狀，這兩種臨床癥狀都可能阻礙唾液的收集，而導致唾液出現不同的稠度和濃度。為了消除唾液分泌的影響，我們在進行唾液中參數評估時，應該將參數標記為標準化后的總蛋白含量或唾液流速。
第三步，分析其他參數對實驗結果的影響。在臨床試驗收集時，我們一般也會納入年齡、性別、藥物接觸、疾病持續時間以及同時罹患其他疾病等參數，此時可采用單因素Cox回歸分析、多因素Cox回歸分析等統計學方法，計算風險系數，以評估這些參數對實驗結果的影響。
Tips：
1）藥物影響。很多時候，我們選取入選病人的時候，他們難免會需要長期服用一些治療藥物，而這些藥物有時會對實驗產生影響，此時如果為了排除藥物影響而人為的讓患者停藥就顯得不那么實際了。在本篇文章中，作者的研究對象關注在帕金森病的人群中，帕金森病病人會服用多巴胺類藥物，其通過外源性地補充黑質紋狀體的多巴胺來治療疾病。作者通過將藥物與待檢測標志物進行相關性分析，如下圖，結果顯示兩者之間的相關性無統計學差異，可排除藥物的對參數的干擾。
綜上，本篇論文有很多值得我們借鑒學習的地方，后期讀者們在開展臨床試驗的時候可以參考。但本研究也有幾個局限性：
1）本實驗為單中心臨床研究，實驗結果會有一定的地域偏差，后期讀者們可以開展多中心臨床研究，會更有參考價值。
2）本篇文章樣本量相對較少，增加樣本量可以增加結果可行度。
3）PD的臨床表現包括運動癥狀，即運動過緩、肌強直、靜止性震顫和姿勢步態異常。除運動癥狀外，帕金森病患者同時伴隨多種非運動癥狀，比如情緒異常（抑郁或冷漠）、睡眠障礙、快速眼動行為障礙（RBD），感覺障礙（如嗅覺減退）、自主神經系統疾?。ㄈ缰绷⑿缘脱獕骸⒚谀蛏诚到y功能障礙、便秘和多汗癥）和認知障礙等。其中一些非運動癥狀，包括RBD、便秘、貧血等，可能出現在運動癥狀幾年或幾十年前出現，可稱為“前驅”或“前運動”階段的疾病，可利于疾病的早期診斷。本實驗雖然探討了PD疾病分期對和待測量生物標志物的相互影響，但未區分PD不同臨床癥狀對檢測分子的影響，后續讀者們在設計臨床試驗的時候可以加入癥狀區分，以增加檢測分子的臨床癥狀的特異性。
盡管目前關于唾液分析對PD的診斷價值的實驗研究已經取得了一定的進展，但尚缺乏PD診斷的靈敏度、特異性及研究的可重復性，后期研究者們需要開展更多的實驗研究進行進一步的探討。同時，制定出規范化的唾液的采樣、儲存、處理、加工和分析技術也十分重要。所以，研究者們有必要盡早建立起唾液樣本庫，并進一步完善唾液的采集、貯存、成分分離和檢測技術，使之標準化。在次，我們希望未來能有更多的實驗室關注唾液對于疾病診斷的課題研究，并對其進一步研究驗證，使得如此“價廉物美”的唾液樣本，能成為一個很好的診斷工具。
文章的最后，再給大家推薦一個利用唾液檢測疾病以開展出更多的臨床試驗的小妙招。
Tips：
唾液數據庫。本文前面已經給各位讀者們推薦了，可以通過目前所研究的疾病中已存在的蛋白生物標志物，通過公共數據庫去預測其靶向調控的非編碼RNA，并進行檢測。此外，讀者們還可以利用另一個寶貴的數據庫，即目前唯一一個致力于唾液組學研究的網站，Salivaomics Knowledge Base (SKB) （http://www.skb.edu）。唾液中含有豐富DNA、RNA、蛋白質、細胞因子，以及大量微生物和其代謝產物等，SKB網站上則存儲了大量人類唾液生物學、蛋白質組學、基因組學等方面的信息。讀者們后續可以在該網站上系統性地搜集唾液組學相關的數據資料，確定疾病的研究分子。
參考文獻：
Pawlik P, B?ochowiak K. The Role of Salivary Biomarkers in the Early Diagnosis of Alzheimer's Disease and Parkinson's Disease. Diagnostics (Basel). 2021;11(2):371. Published 2021 Feb 22.
Cressatti M, Juwara L, Galindez JM, Velly AM, Nkurunziza ES, Marier S, Canie O, Gornistky M, Schipper HM. Salivary microR-153 and microR-223 Levels as Potential Diagnostic Biomarkers of Idiopathic Parkinson's Disease. Mov Disord. 2020 Mar;35(3):468-477.
