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WES和RNAseq聯合分析晚期NSCLC患者免疫治療療效相關分子標志物
一、研究背景
PD1/PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3等免疫檢查點抑制劑的開發將癌癥治療領入全新的免疫治療時代，激活體內免疫系統殺傷腫瘤細胞取得很好治療效果的同時，嚴重的治療副作用（irAEs）、只有20%的獲益人群比例和高昂的治療費用，使得這種療法難以大范圍推廣。如何篩選獲益人群成為治療的首要問題，很多分子標志物已被證實可以有效預測ICIs療效，如PD-L1表達、TMB、TNB、發炎的腫瘤免疫微環境，特定癌種如結直腸癌中MSI不穩定性檢測、MMR相關基因表達檢測等。
二、結論
來自Broad Institute的科研人員，對SU2C-MARK隊列393名經免疫檢查點抑制劑一線治療的晚期NSCLC患者，綜合進行WES和RNAseq測序分析，結合臨床治療療效(完全緩解/部分緩解 or 穩定 or 進展)評估分組，全面解析與積極應答和無反應的差異療效相關分子標志物。研究發現，ATM變異顯示有較好的響應率，而TERT擴增跟無應答相關；在轉錄組水平，免疫蛋白酶體的誘導組分(PSME1、PSME2、PSMB9)的表達與應答之間具有顯著關聯；一種腫瘤內在的去分化類型也顯示出較好的應答率。
三、研究結果
1. 樣本信息
本次研究共收集來自9個癌癥研究中心共393名患者在免疫治療前的FFPE樣本，WES大多數采集的是腫瘤組織和配對血液對照，極少數采集的是癌旁組織對照，隊列中其中一個亞組(n=152)進行了RNA測序。81%的患者經過PD1/PD-L1單藥治療，17%聯合CTLA-4治療，1%聯合化療，最佳總體緩解（BOR）情況經過專業的臨床影像學技術人員評估，并通過RECIST v1.1量化分組為CR/PR、SD和PD。
病理結果顯示，393名患者中，73%屬于肺腺癌，20%屬于肺鱗癌，2%為大細胞神經內分泌肺癌和4%的其它組織類型。PD-L1免疫組化結果發現，43%的患者缺乏PD-L1染色評估，成功染色的患者中25%的腫瘤比例評分（TPS）<1%，33%的TPS位于1%-49%，42%的患者PD-L1高表達，TPS>=50%。
2. 與療效相關基因組特征
首先對患者WES數據進行全面的分子檢測，包括點突變、indel、focal CNV、亞克隆、突變特征、HLA分型與LOH、新生抗原、TCR/BCR等。結果顯示，TMB和主克隆突變負荷是最佳預測因子，另外TNB、新生抗原主克隆突變負荷、吸煙分子特征、特定indel分子特征對療效也具有預測作用，可綜合進行考量。
點突變檢測結果顯示，常見肺癌驅動基因變異均被檢出，如TP53、KRAS/STK11共突變、CDKN2A、EFGR、ATM等。不同臨床分組TMB差異明顯，CR/PR組14.0 mut/MB，SD組9.0 mut/MB,PD組7.4 mut/MB。對49個經典的肺癌驅動變異跟臨床分組進行logistic回歸分析，其中ATM突變具有顯著相關性（FDR q value=0.04,OR=3.5,95%CI=(1.5,8.0)），該結論在另外的MSK-IMPACT隊列中也得到了驗證。接下來的相關變異是EGFR(q value=0.12,OR=0.29,95%CI(0.11,0.79))。
對focal CNV檢測結果同樣進行logistic回歸分析發現，5p15.33區帶拷貝數變異跟療效顯著相關(q value=0.07,OR=0.59,95%CI(0.40,0.87)，其中包含TERT基因。
免疫逃逸相關B2M loss、HLALOH導致的HLA雜合位點減少在本隊列中均沒有發現療效相關性，TCR burden具有相關性但不顯著。
圖1.WES分析結果
3. 與療效相關轉錄組特征
表達分析與免疫微環境
按CR/PR和SD/PD患者分組進行差異表達分析，蛋白酶體誘導亞基PSME1、PSME2、PSMB9在CR/PR組中顯著高表達，它們編碼不同的蛋白酶體組分，受INFγ和TNF調控，可增強短肽的抗原呈遞作用，從而提高響應率。同樣高表達的還有炎性趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11及其淋巴細胞受體。β-catenin代謝通路相互作用轉錄因子AUTS2和TCF7L1、NK-kB通路負調節基因PDLIM3在SD/PD組顯著高表達，跟免疫無應答有關。對Hallmark Gene Sets的 GSEA結果顯示，較好應答與同種異體排斥、INFγ、DNA修復相關基因集顯著富集有關，而EMT、Wntβ-catenin信號通路、TGF-β通路基因富集跟耐藥有關。
使用先前鑒定的單細胞亞群表達特征，在RNAseq數據集上進行logistic回歸分析，發現CD8+T細胞耗竭跟應答強相關，而單核/巨噬細胞、樹突狀細胞跟抗性強相關。另外使用已有的人和小鼠肺癌中浸潤性骨髓細胞單細胞數據結果，在本隊列中將hMono 3和hN 3亞型鑒定為與對檢查點阻斷的抗性特別相關。
圖2. 轉錄組表達分析結果
NMF矩陣分解
對770個顯著差異表達基因在患者中的表達矩陣進行B-NMF矩陣分解，得到3個不同的分子亞型M1、M2、M3，都代表包含免疫細胞和細胞基質表達的微環境綜合特征。對三種不同的分子特征進行GSEA分析，發現M1跟EMT（傷口愈合和纖維化基因集）有關，M2跟同種異體排斥和IFNγ有關，M3跟細胞周期相關E2F靶點弱相關，可能反映了增殖性腫瘤特征，最類似之前報道的免疫沙漠表型，M2中應答率相比M1和M3有所增加，跟單細胞表達特征結論一致。
圖3.NMF矩陣分解
腫瘤內在亞型(TI subytpe)
收集來自TCGA-LCNE具有明確病理分型的1000多名NSCLC患者的RNAseq數據，構建免疫應答顯著相關基因以及免疫細胞和基質成分相關基因的表達矩陣，B-NMF將隊列劃分為明確的4個亞簇，其中TI-1和TI-2主要包含腺癌，TI-3主要包含鱗癌，TI-4代表大細胞神經內分泌癌。肺腺癌和肺鱗癌表達標志物NAPSA和TP63在分化良好的TI-2和TI-3中具有預期的譜系標記偏好，而在TI-1中均弱表達，肺譜系標志物的表達降低先前已在低分化腺癌的亞型中描述，低分化的TI-1中富集內胚層譜系標志物基因，如腸道譜系免疫組化標志物TFF1、FGA、CPS1的高表達。去分化的TI-I簇與應答最密切相關，這與該亞型中升高的突變負荷以及其與M2(免疫活化亞型)的更強相關性一致。
圖4.肺癌病理亞型相關基因表達
4. WES和RNA分子特征綜合分析
結合以上來自WES和RNA的多個最佳預測特征，通過相關性矩陣發現3個強相關模塊,C1、C2和C3，且每個子模塊內部特征具有一致的響應關聯。C1反映典型的“傷口愈合”微環境，包括免疫抑制性骨髓和基質特征，C2反映與“免疫活化/耗竭”相關的更經典的細胞因子和免疫環境，包括浸潤性免疫特征和蛋白酶體亞基，C3由與突變負荷相關的特征組成，代表新抗原豐度和增強的免疫識別，C4包含一些弱相關的分子特征，包括EGFR突變，但與中度突變負荷特征負相關，表明該亞型的內在抗性可能主要由較低的新抗原負荷相關。其中免疫活化/耗竭和傷口愈合簇相關特征的評估可增強患者PFS相關預測能力。
圖5. WES和RNAseq預測因子相關性矩陣
5. 單細胞數據分析
對已發表的NSCLC單細胞RNA數據的綜合細胞亞群分類結果，跟WES和RNAseq結合最佳預測因子特征進行關聯分析，發現cluster12對TI-1中去分化肺腺癌亞群的重現，TI-1中代表傷口愈合和免疫激活/耗竭分子特征相關的EMT和TGF-β主要反映成纖維細胞和內皮細胞，而不是間充質細胞，負預測因子AUTS2和TCF7L1在腫瘤內低表達，蛋白酶體在大部分細胞中表達，炎性趨化因子CXCL9可能來自于髓系細胞，CXCL11可能來自于內皮細胞。低分化TI-1跟M2特征雖然具有強相關性，但在單細胞分析結果中顯示包含不同的細胞亞群，提示我們較大的相互關聯塊在單細胞中并不總是代表相同的細胞來源。
圖6. 單細胞分析結果
6. 總結
本文首次對將近400例NSCLC患者免疫治療相關生物標志物進行全方面分析，深入剖析免疫檢查點抑制劑響應與耐藥分子機制。包括基因組水平變異（ATM突變、TERT擴增）、轉錄組水平表達（蛋白酶體誘導組分基因）、微環境分子特征(M1：傷口愈合，EMT和TGF-β基因富集；M2：免疫活化；M3：免疫沙漠)、肺癌病例亞型分子特征（TI-1：去分化肺腺癌，TI-2主要包含腺癌，TI-3主要包含鱗癌，TI-4代表大細胞神經內分泌癌），以及對所有預測因子根據相關性聚合成C1、C2、C3、C4模塊，同時在肺癌單細胞RNA數據中深入發現以上關聯塊所代表的細胞亞群。
