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大家好，今天給大家分享的是2022年9月份發表在Circulation（IF=39.2）的文章。本文通過多組學分析得出遺傳對冠狀動脈疾病風險的影響可能部分是通過血管平滑肌細胞起作用的。在冠狀動脈疾病易感性基因座上發現的藥用候選致病基因有望成為新的治療靶點。
Effects of Coronary Artery Disease–Associated Variants on Vascular Smooth Muscle Cells
冠狀動脈疾病相關變異對血管平滑肌細胞的影響
研究背景：全基因組關聯研究（Genome-wide association studies，GWASs）已在>190個位點確定了與冠狀動脈疾病（coronary artery disease，CAD）密切相關的常見遺傳變異。然而，大多數這些基因座潛在生物學機制仍然未知，這阻礙了將遺傳發現轉化為新的了解疾病機制和開發新治療方法。由GWASs鑒定的CAD相關位點/變異中約有2/3與常規危險因素（例如，低密度脂蛋白膽固醇水平升高和血壓升高）無關，表明大多數CAD易感性基因座不通過傳統途徑發揮作用，因此目前的治療方法未解決問題。相反，GWASs鑒定的許多CAD基因座包含與血管細胞生物學有關的基因，它們直接指向涉及血管壁細胞的新機制。因此，確定血管細胞中的新途徑和治療靶點可能有助于開發新的治療方法，以補充當前針對傳統風險因素的策略。血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁中的主要細胞類型，在動脈粥樣硬化發生發展中發揮重要作用，是CAD的病理狀態。越來越多證據表明，遺傳對CAD風險的影響可能部分通過VSMCs發揮作用。例如許多CAD基因座的遺傳變異已被證明會影響VSMCs基因表達或影響VSMC行為。然而，尚未對來自不同個體的VSMCs生物庫基因組、轉錄組和表型分析進行系統大規模分析。在這里，作者報告了該分析并描述了這些發現如何用于識別新的藥物靶點。
結果：
本研究整體思路如圖1所示。在本研究中，作者用了來自2114人的臍動脈VSMCs。作者對1992個VSMCs生物樣本庫的760000個變體進行基因分型，并通過插補獲得7334165個變體基因型信息。作者還使用鏈特異性文庫對1499個VSMC樣本進行RNA-Seq（在培養物第3代）。此外，對第3代細胞進行了VSMC增殖（n=2025樣本）、遷移（n=2019）和細胞凋亡（n=2075）測定。對所產生的基因型、RNA-Seq和VSMC行為參數數據集進行了分析，如圖1中。
圖1 研究思路流程圖。
1．CAD相關變異對VSMCs基因表達/剪接的影響
使用來自RNA-Seq數據，作者進行了多維度分析，比較了本研究中VSMCs轉錄組與來自人類冠狀動脈平滑肌細胞轉錄組數據和其他類型細胞/組織轉錄組數據。分析表明，本研究中VSMCs基因表達譜比其他任何細胞/組織類型更接近人類冠狀動脈平滑肌細胞（圖2）。
圖2 本研究中VSMCs基因表達譜與人類冠狀動脈SMCs和其他類型細胞/組織的比較。
2．VSMCs中CAD關聯與eQTL信號共定位
疾病GWASs和eQTL信號之間的共定位已被用作一種精細映射方法，已成功識別疾病風險位點的候選因果變異和候選因果基因。因此，作者將該研究中CAD GWAS和VSMC eQTL數據進行了共定位測試。作者應用了2種共定位工具：eCAVIAR23和SMR/HEIDI。最近一項人類冠狀動脈平滑肌細胞共定位研究報告了5個基因（SIPA1、TCF21、SMAD3、FES和PDGFRA），在eCAVIAR或SMR分析中顯示出與CAD GWAS信號顯著共定位。在該研究中，其中三個基因（TCF21、SMAD3和FES）在eCAVIAR和SMR分析中均顯示出顯著共定位。此外，在eCAVIAR或SMR分析中檢測到81個基因（總共84個基因，包括TCF21、SMAD3和FES）的eQTL信號與CAD GWAS信號顯著共定位，其中18個在兩種分析中都顯示出顯著共定位）。在本研究中觀察到的幾個代表性基因座中VSMC eQTL和CAD GWAS信號之間的共定位如圖3所示。84個候選因果基因染色體位置如圖4A所示。功能通路分析揭示了幾種生物通路的富集，例如轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路，其中包括TGFβ1、BMPR2、BMP1和SMAD3（圖4B）。
圖3 CAD GWAS和VSMC eQTL信號共定位。A，表達數量性狀基因座（eQTL）和GWAS相關區域因果變異識別（eCAVIAR）分析CAD GWAS和VSMC eQTL信號共定位結果。B，SMR/HEIDI分析中基于匯總數據的孟德爾隨機化/異質性結果。C，TCF21 eQTL信號在VSMCs中與TCF21基因座處的CAD GWAS信號共定位。D，SMAD3 eQTL信號在VSMCs中與SMAD3基因座處的CAD GWAS信號共定位。E，VSMCs中FES eQTL信號與FES基因座處CAD GWAS信號共定位。F，MIA3 eQTL在VSMCs中與MIA3基因座處的CAD GWAS信號共定位。G，TGFB1 eQTL信號在VSMCs中與TGFB1基因座處的CAD GWAS信號共定位。H，VSMCs中REST eQTL信號與REST基因座處的CAD GWAS信號共定位。
圖4 候選因果基因染色體位置（A）和功能通路（B）。A，方框表示不同染色體，編號從1到22，每個方框內顯示細胞遺傳學條帶。方框外部線條代表冠狀動脈疾病相關變異，這些變異在血管平滑肌細胞中具有eQTL或剪接數量性狀基因座（splicing quantitative trait locus，sQTL）效應。B，顯示了一些候選因果基因富集的已識別功能途徑。
3．候選致病基因的成藥性
VSMCs中具有eQTL信號的84個候選因果基因中有25個在eCAVIAR或SMR分析中顯示與CAD GWAS信號顯著共定位，確定了38個可成藥基因（圖5），表明它們是潛在治療靶點。此外，對藥物基因相互作用數據庫的查詢表明，84個候選因果基因中有13個具有藥物-基因相互作用的證據（圖5）。
圖5 與CAD GWAS信號顯著共定位的VSMCs中具有eQTL信號基因的成藥性。
4．與VSMC行為相關的共表達基因模塊
使用VSMC轉錄組和細胞行為數據集，作者研究了基因表達水平和VSMC行為之間可能存在的關聯。預計VSMC行為同時受到許多基因影響，作者進行了WGCNA。WGCNA分析揭示了幾個共表達基因模塊與各種VSMC行為參數高度顯著關聯（圖6和7）；例如，MEgreen模塊與VSMC增殖負相關（圖6和6B），而MEturquoise模塊與細胞凋亡負相關（圖7A和7B）。為了測試MEgreen模塊中樞基因YIPF6對VSMC增殖的影響以及MEturquoise模塊中樞基因SLC25A36對細胞凋亡的影響，作者用siRNA介導的YIPF6敲低在VSMCs中進行了增殖測定，并在VSMC中用siRNA介導的SLC25A36敲低進行了細胞凋亡測定。實驗表明，YIPF6敲低增加了VSMC增殖（圖6C），而SLC25A36敲低促進了VSMC細胞凋亡（圖7C）。GO分析表明，各種共表達的基因模塊在特定生物過程、細胞成分、分子功能和功能通路中具有顯著富集。例如，MEgreen模塊在吞噬體、膜運輸和囊泡介導的轉運相關通路中顯著富集（圖6D），而MEturquoise模塊在參與鈣粘蛋白信號傳導、Wnt信號傳導和編碼細胞外基質蛋白中顯著富集（圖7D）。
圖6 與VSMC增殖和功能途徑相關的共表達基因模塊。A，共表達基因模塊與VSMC增殖相關性熱圖。B，個體基因表達水平與低強度EdU染色陽性VSMCs百分比相關系數。C，MEgreen模塊中樞基因YIPF6對VSMC增殖的影響。D，MEgreen模塊中富集的生物途徑。
圖7 與VSMC凋亡和功能通路相關的共表達基因模塊。A，共表達基因模塊與VSMC凋亡參數相關性熱圖。B，個體基因表達水平和星孢菌素處理4小時后低強度EdU染色陽性VSMCs百分比相關系數。C，MEturquoise模塊中樞基因SLC25A36對VSMC凋亡的影響。D，MEturquoise模塊中富集的生物途徑。
結論：
本研究對VSMC基因組、轉錄組和細胞行為數據進行綜合分析，確定了84個可能通過VSMC調節CAD風險的基因，其中一些基因（例如：TGFB1、SMAD3、BMP1和BMPR2）可能與影響VSMC行為通路相關。在已確定的候選致病基因中，38個具有潛在成藥性，因此有希望成為治療靶點。這些發現可用于為局部靶向VSMC新療法的開發提供信息，并補充當前針對傳統CAD風險因素的干預措施。
參考文獻：Solomon C U, McVey D G, Andreadi C, et al. Effects of Coronary Artery Disease-Associated Variants on Vascular Smooth Muscle Cells[J]. Circulation. 2022,146(12):917-929.
