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Defining HPV-specific B cell responses in
patients with head and neck cancer
頭頸癌患者中鑒定出HPV-特異性B細胞反應
2020年11月發表在Nature（IF: 49.962）上的文章。本研究從43名患者身上切除的頭頸部腫瘤樣本，在HPV陽性的頭頸癌患者的樣本中檢測到HPV特異性B細胞反應，并且原位檢測到HPV特異性IgG抗體，同時觀察到類似于生發中心的結構，這些結構類似于淋巴結中的用于在免疫反應期間對B細胞進行“訓練”的生發中心。
摘要:
腫瘤通常含有B細胞和漿細胞，但這些瘤內B細胞的抗原特異性尚不清楚。在HPV陽性的頭頸部癌癥患者的樣本中檢測到特異性B細胞反應，其活躍地產生hpv特異性IgG原位抗體。在腫瘤微環境中存在hpv特異性抗體分泌細胞(antibody secreting cells-ASCs)，感染的細胞很少會出現該旁觀者招募的現象，暗示HPV感染導致B細胞存在局部和抗原特異性的ASC反應。人乳頭瘤病毒特異性ASC反應與血漿IgG滴度相關，直接針對人乳頭瘤病毒E2、E6和E7蛋白，其中對E2的反應最為顯著。利用瘤內B細胞和漿細胞，我們生成了幾種hpv特異性的人單克隆抗體，這些抗體表現出高度的體細胞高突變，與慢性抗原暴露一致。單細胞RNA測序分析檢測到腫瘤微環境中激活的B細胞、生發中心B細胞和ASCs。與腫瘤實質相比，B細胞和ASCs優先定位于腫瘤間質，并有形成良好的激活簇。
B細胞表明正在進行的生發中樞反應。總的來說，我們發現在腫瘤微環境中可以發現抗原特異性激活和生發中心B細胞以及漿細胞。該發現能夠幫助人們更好理解人類癌癥中體液免疫反應，并暗示腫瘤浸潤的B細胞可以用于開發治療藥物。
腫瘤微環境(TME)中存在hpv特異性抗體分泌細胞
我們獲得了手術切除的表達p16的頭頸部鱗狀細胞癌樣本，p16是一種廣泛使用的HPV狀態的替代標記物，特別是在口咽鱗癌中。我們使用基因組來確認HPV狀態，在43例頸部鱗狀細胞癌患者中選取32例p16+患者，并從福爾馬林固定石蠟包埋切片中分離DNA。32份樣本中有31份檢測出HPV DNA，大多數病例(84.4%)檢測出HPV type 16陽性。接著對來自浸潤在原發腫瘤的淋巴細胞(TILs)和來自p16+頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)患者內的轉移性淋巴結(metLNs)和外周血單個核細胞(PBMCs)進行抗體分泌細胞(ASCs)量化。與外周學血相比，metLNs和TILs顯示ASCs明顯富集。metLNs和TILs中的ASCs主要產生IgG，其次是IgA和IgM, 分泌IgG+的ASCs占淋巴細胞總數的0.11% ~ 3.8%。相比之下，p16+ HNSCC患者外周血中的ASCs的頻率較低，表現出不同的同型分布(IgA≥IgG>IgM)，在頻率和同型分布上 與健康個體外周血ASCs相當。
接下來試圖尋找TME中的ASCs是否產生針對HPV抗原產生特異性抗體。
進一步檢測發現，metLNs(轉移性腫瘤淋巴結)和TILs(腫瘤浸潤淋巴細胞)中IgG+ ASCs能夠產生HPV蛋白E2、E6、E7的特異性抗體，且E2特異性抗體反應占據大部分(圖1,a-c)
圖 1 HPV陽性HNSCC患者TME中存在HPV特異性抗體分泌細胞
a表示酶聯免疫吸附點(ELISPOT)顯示TILs中分泌E2、E6和E7特異性IgG+的ASCs。b, c,表示分泌E2、E6、E7特異性IgG+的ASCs,metLNs (n = 38) (b)和TILs (n = 23) (c)。紅色點表示無任何反應的患者。
與之前的報道一致，與p16+腫瘤相比，p16- HNSCC腫瘤lym細胞浸潤明顯減少，ASCs總量差不多，但缺乏hpv特異性IgG+ ASCs。p16- HNSCC患者相對于p16+ HNSCC患者缺少HPV特異的IgG+記憶B細胞。(圖1d)
接下來，我們比較了14例p16+患者TME中流感和HPV特異性ASCs 的數量，在TME中的 ASCs簡單地反映了炎癥驅動的循環招募和分化。雖然流感特異性MBCs在外周血中明顯較高，但HPV特異性ASCs在TME中占主導地位 (圖1d )。這些數據表明，表明HPV特異性IgG抗體在TME中是積極產生的，E2蛋白是體液免疫反應的主要靶點。
ASC與HPV抗體的相關性
腫瘤微環境（TME）存在hpv特異性IgG+中的ASCs促使我們在隊列中調查HPV E2、E6和E7的血清學反應。血漿中抗E2、E6、E7的IgG抗體滴度可以明確區分p16+患者HNSCC(n = 39)從p16- HNSCC(n = 10)（圖2a）。在一組患者中，對HPV E抗原的血漿IgG反應主要由IgG1組成，其次是高度不同水平的IgG3(圖2b)。值得注意的是，HPV特異性IgG滴度與在metLNs和TILs中的ASCs的IgG滴度相關（圖2c）。
圖 2
生成HPV特異性人類抗體
之前已經發現了抗原特異性B細胞的一個子集，稱為“激活B細胞”(ABCs)，這是一種增殖細胞，與ASCs不同，屬于MBC譜系，在接種或感染后存在于外周血。接下來想要探究TME中是否存在hpv特異性的abc，是否可以用于產生hpv特異性的人類單克隆抗體。我們使用熒光激活細胞分選(FACS)和熒光標記的E2蛋白純化hpv特異性ABCs(CD19+
IgD?CD20+CD71+)（圖3a）。14個成功產生的抗體中有12個(約86%)被識別E2在酶聯免疫吸附試驗(ELISA)中的應用（圖3b）。E2特異性單克隆抗體在重(Vh)鏈和輕(Vl)鏈的可變區表現出高度的體細胞高突變(SHM)，三個克隆譜系分別由兩個克隆表示(圖3c)。此外，在hpv特異性抗體中“激活B細胞”(ABCs)和高度SHM的存在表明這些腫瘤相關病毒抗原與長期和持續的體液免疫反應相關。
圖 3（點的顏色表示對應的抗體）
腫瘤微環境(TME)中B細胞的scRNA-seq分析
從三個HPV+HNSCC患者的metLNs和TILs中獲得B細胞系活化細胞(CD19 +IgD?CD71 +)，并用無監督方法進行單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析（圖4a）。此外，我們從接種季節性流感病毒疫苗7天后的健康參與者外周血中分離出活化的細胞。總共有8271個單細胞鑒定出4個簇(圖4b,c)。在基因表達譜和基因集富集分析的基礎上，我們將細胞簇命名為ABCs、ASCs、生發中心B細胞(GCBs)和過渡細胞(transitory cells)，這些細胞簇表現出ASCs、GCBs和增殖基因集富集的雜交表型。總的來說，在所有的細胞簇中都發現了來自metLNs和TILs的激活細胞，盡管患者之間的分布差異很大（圖4d）。相比之下，在季節性流感疫苗接種7天后，從PBMCs中提取的激活細胞在GCB集群中未被檢測到，在臨時細胞集群中幾乎不存在。
圖 4
B細胞亞群的轉錄組
接著，我們進行了RNA-seq分析，以確定三種主要B細胞亞群之間的轉錄差異(ASCs，ABCs和GCBs)。我們用流式細胞
從兩個HPV+ HNSCC患者的metLNs和TILs進行純化（圖5a），ASCs (CD19+ CD20? IgD? CD38hiCD71+ ), ABCs (CD19+ CD20+ IgD? CD71+ CD10? )，GCBs (CD10+ ABCs)。此外，我們分析了在接種季節性流感疫苗后第7天從健康受試者外周血中分離的ASCs和ABC。為了更廣泛地描述轉錄景觀，我們首先進行了主成分分析，確定了兩個主成分(PC)，它們共同解釋了大約60%的觀測到的轉錄變異（圖5b）。PC1占轉錄變異的41%，能清晰區分ASCs、ABC和GCB，還能從血液ABC中分離出組織。通過k-means聚類對單個基因進行基因表達分析，確定了6個基因簇，根據分類的子集以及樣本來源(血液和組織)來區分樣本(圖5c)。ASC的特征是表達增加常見的ASC相關基因如XBP1、MZB1、CD27和CD38的，而B細胞譜系是表達降低的基因如MS4A1、IRF8和CD24的。腫瘤來源的ASCs顯示額外的漿細胞相關基因如PRDM1, SDC1的表達增加。與這些數據一致，大部分ASCs在TME(n = 14)不表達Ki67，這表明腫瘤相關ASCs更像漿細胞表型。GCB表達高水平的BCL6, AICDA, MME和S1PR2。值得注意的是，來自外周血的流感特異性細胞不同于腫瘤來源的細胞，它們高表達參與細胞遷移的基因，如CD52、S1PR4和ITGA3。
圖 5
B細胞瘤內定位
接著，我們開始研究B細胞和ASCs在7例HPV +頭頸部鱗狀細胞癌定位（圖5d）。總B細胞(CD19+CD20 +)和ASCs (CD19+
CD20?IRF4 +)在基質中比p16+腫瘤更為普遍（圖5e）。激活B細胞(CD19+CD20+Ki67+)傾向于在間質中以更高的密度存在，在腫瘤間質中有形成良好的ABC簇，表明生發中心反應(圖5e)。TME中ASCs主要為Ki67?但CD138的表達差異很大，提示漿細胞分化的不同階段。
總的來說，我們的數據顯示，在TME中存在幾種不同的抗原特異性B細胞亞群，包括ABC、GCBs、最近生成的漿細胞和處于不同分化階段的漿細胞。
方法
樣品的采集、制備和儲存
接受手術的HNSCC患者是根據經批準的Emory大學機構審查委員會協議(WINSHIP4008-17)招募，所有患者都提供知情同 意。所有患者在手術時都曾有未經治療的局部晚期疾病，表 現為局部轉移性淋巴。組織樣品被切成小塊，分離淋巴細胞。 在手術時在檸檬酸鈉CPT細胞制備管(BD)中采集外周血樣本，并立即處理以獲得PBMCs和血漿。對照樣本來自健康的個人。
流式細胞
用流式細胞儀進行細胞分選。
抗原
重組HPV抗原與麥芽糖結合蛋白(MBP)融合在大腸桿菌中表達。
編碼 HPV16E2(UniprotP03120) ，HPV16E6(UniprotP03126)和HPV16E7的DNA序列 從合成的 E2-E6-E7基因結構 (Genscript)中擴增Uniprot P03129。采用2018-2019年或2019-2020年季節的四價滅活季節性流感疫苗Fluarix(GSK)來評估流感特異性反應。
ELISA和ELISPOT
ELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。
ELISPOT是用于在單細胞水平檢測細胞因子(CK)分泌細胞和抗體分泌細胞(ASC)的一項細胞免疫學檢測技術。通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下或通過儀器對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（詳細流程請參考原文）
免疫印跡
通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。（詳細流程請參考原文）
HPV分型
用BLAST對PCR產物進行純化、測序和分析。（詳細流程請參考原文）
抗體制備
asc (CD3/14/16?CD19 +CD20?IgD?CD38hiCD71 +)或E2特異性激活的B細胞(CD3/14/16?CD19+CD20+IgD?CD71+MBP-E2 +)的單細胞分選到96孔板含有細胞裂解緩沖液。如前所述進行IgG重鏈和輕鏈基因的克隆，并進行少量修飾。
通過IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)分析V(D)J的使用情況和對克隆的單克隆抗體進行SHM序列分析。
多重免疫組化和圖像分析
采用OPAL Polaris系統(Akoya Biosciences)進行七色多重免疫組化。使用Vectra Polaris多光譜成像系統對染色玻片進行成像和掃描。高分辨率全片掃描圖像的隨機腫瘤區域(包括腫瘤實質和基質)首先在PhenoChart 1.0.12 (Akoya Biosciences)中注釋，然后使用inForm2.4.8軟件(Akoya Biosciences)進行分析。使用DAPI和P16作為腫瘤的標記物來識別腫瘤實質和間質區域。對于HPV陰性腫瘤，CD138被用作腫瘤的替代標記物。基于核DAPI和膜質CD20完成自適應細胞分割。從感興趣的免疫細胞表型中，至少有25個細胞被手工選擇，并用于訓練軟件進行自動分析。數據R包phenoptr (v.0.2.5) 和phenoptrReports (v.0.2.6)進行處理(Akoya Biosciences)。
scRNA-seq分析
使用Cell Ranger v3.1進行比對、過濾、條形碼計數和唯一分子標識符計數。使用Seurat v.3.1.4對數據進行更深一步的分析。所有單細胞分析使用R .3.6.2進行。簡言之，包括線粒體基因百分比低于0.07%的細胞。檢測到的基因超過6000個或少于1000個的細胞被認為是異常細胞，并被排除在下游分析之外。使用Seurat函數“FindIntegration Markers”將來自不同患者的樣本合并，該函數識別并計算數據集對之間的錨，以減少樣本批處理效果。由于免疫球蛋白基因轉錄本構成ASC/GC簇的轉錄組的大部分，因此除另有說明外，免疫球蛋白基因被排除在分析之外。原始唯一分子標識計數歸一化到每百萬總計數和對數轉換的唯一分子標識計數。根據平均表達和離散度選擇可變基因。進行主成分分析，使用統計最顯著的前6個主成分進行UMAP分析。基于主成分分析維度生成聚類和UMAP圖。每個聚類內差異表達的標記基因由Seurat函數“FindAllMarkers”鑒定，平均對數倍變化截斷值為0.5。將前10個標記基因的比例表達數據制作熱圖。歸一化數據以特征圖或小提琴圖的形式表示。基因集評分使用VISION R軟件包v.2.1.0，按照前面描述的評分算法進行。簡而言之，特征基因的表達是基于從最近鄰處計算出的預測退出概率進行加權，并對基因集中所有基因進行歸一化求和。ABC和ASC基因集已在前面描述過。用VISION包計算每個群體的簽名分數并轉換為二進制數字向量，并對具有Yates連續性校正的二進制變量進行Pearson 卡方檢驗，以確定統計意義。采用Bonferroni校正對P值進行調整，P值 <0.05表示顯著。
RNA-seq分析
使用HISAT2將基因序列與人類基因組進行了比對(GRCh38;通過Ensembl訪問)。用samtools匹配并進行排序和索引，使用featurecots函數對齊匹配到Ensembl參考轉錄組的reads。使用DESeq2進行庫大小的歸一化、對數轉換和差異表達分析。使用FactoMiner R軟件包對對數轉換數據進行主成分分析。采用R中的k-means函數進行k-means聚類，聚類數量通過共識聚類確定。用ggplot2 R軟件包對數據進行可視化。
統計分析
在小提琴圖中，數據以平均值±標準誤，或中位數和四分位數表示。多組比較采用Friedman檢驗和雙側Dunn多重比較檢驗。雙尾采用Mann-Whitney方法比較HNSCC p16? 和p16+患者的hpv特異性IgG抗體滴度和。采用配對雙尾t檢驗比較ASCs在PBMCs和組織中的Ki67表達。在相關分析中，進行了 Spearman相關，并提供了r和雙尾P值。雙向重復測量采用方差分析和Sidak多重比較檢驗比較不同B細胞亞群在TME中的分布情況。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。所有統計分析均使用GraphPad Prism v.8.3進行。沒有使用統計學方法來預先確定樣本量。實驗不是隨機的，研究人員在實驗和結果評估過程中對分配也不是盲目的。
總結：
hpv特異性抗體在hpv相關癌癥中的作用尚不清楚。然而，兩項研究表明，HPV特異性抗體滴度的增加與HPV+患者生存率的提高和復發風險的降低有關。數據顯示，TME中hpv特異性抗體滴度與ASCs之間存在明顯的相關性。因此，我們很容易推測，TME中hpv特異性ASCs的存在可能也與改善臨床結果有關。然而，需要進一步的研究來解決是否增加通過HPV-specific抗體提高患者生存率。
