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Nature子刊|辯證看待PD-1PD -L1免疫治療標志物

        哈嘍，好久不見，開門見山，今天小編向大家分享的是一篇發表在Nature子刊《Nature Communications》（IF:14.919）雜志上的文章，主要講解了不同腫瘤類型對PD-L1阻斷反應的分子決定因素。免疫檢查點阻斷可以說是近幾年的明星課題，PD-1/PD-L1抑制劑免疫療法也確實為很多患者帶來了福音，但目前仍沒有有效的預測生物標志物來指導臨床精準用藥。當所有人都攪破腦汁想要尋找新的預測生物標志物的時候，卻有人獨辟蹊徑，不僅否定了別人找到的預測標志物，還推翻了自己千辛萬苦的找到的預測基因簽名。真可以說是學術圈的“杠把子”了，還杠出了一篇Nature子刊，趕快隨小編一睹為快吧~

患者來源

從atezolizumab的三個II期臨床試驗中總共選擇了366名患者進行分析。

①IMvigor210（NCT02108652）是一項關于atezolizumab用于治療膀胱癌的II期臨床試驗，共招募了兩組患者。第一組包括119名不適合順鉑化療的晚期初治患者，使用atezolizumab進行一線治療；第二組招募了316名鉑類化療失敗的患者，使用atezolizumab進行二線治療。本研究中選擇是來自第二組中的208名轉移性尿路上皮癌(mUC)患者。

②POPLAR（NCT01903993）是一項多中心、隨機、開放、2期臨床研究，旨在評估atezolizumab在含鉑方案治療進展后局晚期或轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)患者中的療效和安全性，納入287例NSCLC患者，根據PD-L1在腫瘤浸潤免疫細胞中的表達情況、組織學分型、繼往治療方式將這些患者隨機分組。其中atezolizumab組144例，多西他賽(docetaxel)組143例。本研究選擇的是來自atezolizumab組中的81名NSCLC患者。

③IMmotion150研究是在轉移性腎細胞癌(RCC)患者中開展的第一項評估atezolizumab與貝伐珠單抗(bevacizumab)聯用的療效和安全性的多中心、開放標簽II期研究，患者隨機分為3組，A組給予atezolizumab+貝伐珠單抗治療；B組給予atezolizumab治療；C組給予舒尼替尼治療。本研究選擇的是來自A組或B組中的77名RCC患者。

結果展示

Part 1. PD-L1表達情況和腫瘤突變負擔評估

通過免疫組化分別對腫瘤細胞（TC）和浸潤免疫細胞（IC）中PD-L1表達水平進行評估。根據表達水平對細胞進行分級：0級(<1%)，1級(≥1%但<5%)，2級(≥5%但<50%)，3級(≥50%)，1、2或3級，均被歸類為PD-L1陽性(≥1%)。

患者客觀反應率（ORR）主要包括：反應[完全反應(CR)/部分反應(PR)]或無反應[穩定疾病(SD)/漸進性疾病(PD)]。

結果顯示，在這3種腫瘤患者中均未觀察到ORR存在顯著差異。mUC、NSCLC和RCC客觀反應率分別為21.6%（45/208）、13.6%（11/81）和19.5%（15/77）（補充圖1b）。74.0%(154/208)的mUC、70.4%(57/81)的NSCLC和62.3%(48/77)的RCC腫瘤為PD-L1+（補充圖1c）。在所有3種腫瘤中，應答者均表現出PD-L1陽性比例增加（圖1a）。這種PD-L1評分方案靈敏度較高（83.1%），但特異性較低（32.2%）[mUC：84.4%/28.8%；NSCLC：90.1%/32.9%；RCC：73.3%/40.3%]。

為了評估腫瘤突變負荷（TMB）對檢查點抑制劑療法效果的預測能力，作者進一步選擇了246個樣本（144mUC、50NSCLC和52RCC）的全外顯子測序結果進行分析（見補充圖1a）。

結果顯示，TMB在這3種腫瘤患者中存在顯著差異，mUC患者(中位數17.7 mub./mb)和NSCLC患者(中位數15.5 mub./mb)的TMB顯著高于RCC患者(中位數10.9 mub./mb)，這與TCGA中的數據結果一致(補充圖1d)。mUC應答者的TMB顯著升高，在NSCLC中也有同樣趨勢，但在RCC患者中應答者與非應答者之間的TMB無顯著差異(圖1b)。

根據中位數(16.3mu./mb)，進一步將樣本分為TMB^high或TMB^low，TMB檢測應答者的總體敏感性和特異性分別為70.6%和55.4% (mUC: 79.4%/47.3%；非小細胞肺癌:66.7%/56.1%；RCC: 37.5%/75.0%)，對mUC患者的靈敏度最高。

接下來，作者還聯合分析了PD-L1和TMB的預測能力，結果顯示，在總共檢測的246例腫瘤中，PD-L1⁺和TMB^high合并的腫瘤有207例(84.1%)，其中51例來自應答者(圖1c)。其中PD-L1⁺和TMB^high為31例(60.8%)，PD-L1⁺為10例(19.6%)，TMB^high為5例(9.8%)。另有5例(9.8%)患者同時患有PD-L1^-和TMB^low。作者認為聯合使用PD-L1表達和TMB能夠識別大部分應答者，具有較高的檢測靈敏度。然而，PD-L1⁺和/或TMB^high腫瘤也包括161/195(82.6%)非應答者，所有腫瘤組均出現了假陽性和假陰性，表明這種檢測方法的特異性較差。這提示我們腫瘤具有特異性反應機制，促使我們尋找新的生物預測標志物，以更準確地檢測不同類型腫瘤的應答者。

Part 2. 腫瘤預處理后的轉錄景觀

為了進一步分析PD-L1表達和TMB對免疫檢查點的影響，作者通過RNA-seq分析預處理后的腫瘤轉錄組。結果顯示，樣本主要按腫瘤類型聚類(圖1d)。在mUC和NSCLC腫瘤之間觀察到重疊，而RCC腫瘤是離散聚集的，這可能是由于組織特異性和腫瘤發生機制不同綜合影響的結果。這種聚類模式在TCGA和PCD4989g的兩個獨立數據集中也得到了確認(補充圖2a)。

Part 3.免疫檢查點抑制劑簽名的預測性能

為了進一步尋找有效的生物預測標志物，作者希望能夠通過機器學習建立一個可以預測腫瘤患者對atezolizumab反應的基因簽名。通過366名患者的轉錄樣本（訓練集）作者得到了加權的58個基因簽名(補充數據2)，同時在PCD4989g隊列的206個樣本（驗證集）[mUC(n = 94)、NSCLC (n=54)、RCC(n = 58)]中進行驗證（見補充圖1a）。

結果顯示，可以在訓練集中顯著區分應答者和非應答者(圖2b)。在POPLAR的多西他賽組(NSCLC)和IMmotion150的舒尼替尼組(RCC)中，應答者和非應答者之間基因簽名分數沒有顯著差異，說明該基因簽名對atezolizumab應答具有預測價值(圖2b)。

為了評估此簽名對應答者接受atezolizumab治療效果的預測能力，作者在訓練集和驗證集中都繪制了ROC曲線，同時還包括PD-L1、TMB的ROC曲線。

結果顯示，在訓練集中，這個基因簽名在246個RNA-seq和TMB樣本中具有很高的準確性(紅色曲線，AUC=0.99)(圖2c)，而TMB(黑色曲線，AUC = 0.69)和PD-L1(藍色曲線，AUC = 0.60)的AUC均較低。有趣的是，在RNA-seq、PD-L1和TMB之間沒有觀察到協同作用，表明RNA-seq可以能夠單獨概括PD-L1表達和TMB的生物學基礎。

此外，作者還繪制了其他5項已報道的預測因子的ROC曲線，均表現出糟糕的預測性能，最高AUC為0.60。

在驗證集中，所有上述的預測因子都顯示出較差的預測能力，包括作者提出來的58個基因的簽名（圖2d）。

為了提高結論的可靠性，作者在訓練集和驗證集上采用其他不同的機器學習算法進行了重新測試，都得到了相似的結果。這些發現表明，雖然機器學習方法可以通過單數據集的交叉驗證來識別高度準確的簽名，但獨立數據集的驗證仍然具有挑戰性，可能會受到樣本量低、腫瘤異質性以及不同隊列之間臨床差異的影響（補充圖6）。

Part 4. PD-L1與TMB的轉錄相關物

接下來，作者分析了與atezolizumab反應相關的生物途徑，建立了一個包括應答、腫瘤類型、PD-L1表達和TMB在內的模型。

首先鑒定了與PD-L1表達相關的基因，其中過表達基因1325個，低表達基因463個(補充數據3)。過表達基因主要為免疫相關基因，包括IFN-γ誘導的趨化因子(CXCL9, CXCL10, CXCL11和CXCL13)，檢查點(CTLA4和IDO1)，以及細胞毒性編碼基因(GZMA, GZMB, GZMH, GZMK和PRF1)和B/漿細胞生物學(CD79A, JCHAIN, IGLL5, MZB1, TNFRSF13B和BLK)。

同樣，作者比較了TMB^high和TMB^low腫瘤的轉錄組差異，其中165個基因過表達，121個基因低表達，表明TMB與轉錄之間的相關性較PD-L1弱(補充數據4)。

結果表明，PD-L1表達對RNA-seq在腫瘤中的轉錄差異貢獻最大，并且與PD-L1水平相關的基因代表了腫瘤免疫浸潤的特征。PD-L1和TMB的轉錄相關物大多是不同的，支持這兩個生物標志物之間的不重疊特征。

Part 5. PD-L1阻斷反應的轉錄相關物

接下來，作者探索了基因表達和atezolizumab反應之間的關系。由于TMB對腫瘤轉錄組影響較小，因此將TMB從模型中去除。

結果顯示，在聯合分析中(圖3a)，應答者腫瘤中ATP生物合成和氧化磷酸化豐富。細胞周期蛋白相關/ DDR(DNA損傷修復)相關基因在mUC和NSCLC腫瘤中富集，可能反映了TMB增加與PD-L1阻斷反應之間的關系。相反，與腫瘤生物學(WNT和PI3K-Akt)和基質生物學(TGF-β、膠原和細胞外基質)相關的模塊在非應答者中富集。

隨后作者分別對PD-L1⁺和PD-L1^-腫瘤進行分析，發現根據PD-L1狀態，不同腫瘤的轉錄組存在顯著差異。在PD-L1⁺ mUC腫瘤中，只有凋亡信號與應答相關。PD-L1⁺ NSCLC轉錄組則以翻譯途徑為主。在PD-L1+ RCC腫瘤中，髓系炎癥、WNT信號傳導和膠原形成與ORR呈負相關(圖3b)。

有趣的是，在107例PD-L1腫瘤中，在3種不同腫瘤中觀察到了一致的轉錄信號，即細胞周期/DDR(DNA損傷修復)與PD-L1腫瘤的應答呈正相關(圖3b)。雖然表明在這種情況下高TMB對阻斷反應有貢獻，但DDR特征和TMB之間的相關性不大(補充數據6)。

Part 6. PD-L1阻斷反應中CDKN2A活性增加

在與PD-L1阻斷反應相關的基因中，CDKN2A上調最多(圖4)。CDKN2A編碼p16(INK4A)，它是細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4和CDK6的內源性抑制劑，可阻止G1/S期轉變并誘導細胞衰老。在許多腫瘤類型中，存在CDKN2A的拷貝數丟失。

為了評估mUC、NSCLC和RCC中CDKN2A缺失的患病率，作者查詢了Foundation Medicine臨床數據庫，其中包括140288例患者腫瘤樣本，以了解部分(1拷貝，CN1)或完全(0拷貝，CN0) CDKN2A缺失患者的患病率。結果顯示，在某些癌癥中顯示頻繁的CDKN2A丟失(圖4b)，包括膀胱癌(39%)、RCC(36%)和非鱗狀細胞癌(34%)。

接下來，作者評估了CDKN2A拷貝數改變和PD-L1阻斷反應之間的關系。結果發現，在CDKN2A缺失的mUC和RCC中觀察到患者對atezolizumab的應答降低，但這種相關性沒有達到統計學意義，可能是由于樣本量低(圖4c)。

最后，作者分析了CDKN2A及其兩個靶點CDK4和CDK6的轉錄水平與mUC和NSCLC的總生存(OS)以及RCC的無進展生存(PFS)之間的關系(圖4d)。結果顯示，CDKN2A增加與mUC中OS改善相關，RCC患者的PFS也有改善趨勢。相反，CDK6的增加與mUC和NSCLC的OS以及RCC的PFS降低相關，而CDK4表達高低對患者生存的影響無顯著性差異。

討論

        在這項研究中，作者通過RNA-seq對366名患者的PD-L1表達和TMB進行轉錄分析，以確定在三種對抗PD-L1單克隆抗體atezolizumab有反應的腫瘤類型中與檢查點抑制劑(CPI)反應相關的分子程序。這項交叉指征分析結合了572名接受atezolizumab治療的患者的現有生物標志物和RNA-seq，顯示了mUC、NSCLC和RCC腫瘤之間顯著的分子異質性。機器學習沒有識別出一個統一的轉錄簽名預測ORR。多種因素決定了對檢查點阻斷的反應，而這些因素在一定程度上依賴于腫瘤類型，這突出了在這一領域開發生物標志物的難度。雖然對PD-(L)1阻斷反應的通用生物標志物可能存在，但考慮適應癥特異性的分子環境來制定下一代聯合治療將是至關重要的。