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Hello,免疫檢查點抑制劑是目前治療腫瘤的最為先進的方案之一，但是一些患者對該方案并不敏感。如何解決這個問題呢？小王本次給大家講解的就是2021年發表在雜志Oncogene(IF: 9.8)的一項研究，該作者是從CD8+T效應（CD8 Teff）出發研究出一個預測模型進而對該治療方案的效果進行預測。接下來為大家講解作者是如何一步一步分析的。
STEP1 WGCNA的構建和關鍵模塊的識別
（1）確定重要的模塊基因
作者從IMvigor210隊列中納入了348位轉移的尿路上皮癌患者的樣本，并選擇了方差大于不同樣本中所有四分之一方差的基因。此外，獲得了2351個基因用于進行WGCNA，并將這些基因用聚類樹狀圖劃分為5個不同的模塊。根據CD8+T效應與免疫檢查點的相關性，最終確定黃色的模塊基因作為構建模型的基因集。如下圖1
（2）對模塊基因進行富集分析
對模塊基因GO與KEGG富集分析，GO功能分析結果為T細胞活化、質膜外、細胞因子受體結合等功能。KEGG結果為造血細胞譜系、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、結核性膀胱通路相關。
STEP2 IMS（免疫靶點抑制劑評分）作為一種預測因子的潛在生物學作用
(1)構建ssGSEA評分
根據黃色模塊基因構建了ssGSEA的評分系統，并量化了每個樣本的預后水平，簡稱IMS。（劃重點）
(2)高、低IMS組的在分子分型或基因之間的分布
將高、低IMS組按照TCGA和Lund分類進行比較，第I亞型在低MIS組中最常見，而第IV亞型最少見。Lund分類中包含一個基因組不穩定的亞型，低IMS組的UroA亞型和高IMS組的Inf亞型所占比例最高。與高IMS組相比，低IMS組有更多FGFR3突變的患者。見圖2
作者研究顯示，低IMS組FGFR3基因標記(FGFE3、TP63和WNT7B)的表達顯著增加，而CD8 Teff標記、抗原加工機制;免疫檢查點等相關基因在高IMS組比低IMS組高表達。
(3)IMS與生存
IMS的生存分析顯示，在抗PD - L1免疫治療隊列中，低IMS組的生存獲益較差。（K-M曲線，很常規啦）
(4)IMS與治療應答
客觀應答組(CR/PR:完全緩解或部分緩解)的IMS顯著低于非應答組(SD/PD:疾病穩定或進展)。圖4
(5)IMS與腫瘤PD-L1表達量之間的關系
隨著腫瘤細胞PD-L1表達等級的增加，IMS顯著增加。不同免疫表型間IMS也有顯著差異。
STEP3 IMS的免疫治療反應性
可以認為該步驟是對IMS與其它參數之間的關系，也是IMS的應用效果的評估。
(1)利用TIDE算法并對其相關指數進行分析
作者使用外部2031例膀胱癌樣本計算出IMS隨后再評估TIDE算法(圖5)，結果顯示IMS與TAM _M2和MDSC水平呈負相關，與CAF含量呈正相關。IMS與功能障礙呈正相關，與EXCLUDE呈負相關。IMS和TIDE評分之間有很強的相關性。
(2)免疫浸潤
隨后，作者們評估了IMS與24種免疫細胞的相關性，發現IMS與M0、M1、M2巨噬細胞、中性粒細胞、T細胞CD8、活化NK細胞、嗜酸性粒細胞呈正相關。 記憶B細胞、記憶活化T細胞、CD4 T細胞和γ δ T細胞的免疫浸潤水平在高IMS組明顯低于低IMS組。見圖6
(3)IMS與信號通路的相關性
作者IMS與膀胱癌重要生物學通路的基因評分進行相關性分析，發現IMS與免疫檢查點、CD8 T效應、APM、EMT1、EMT3評分呈正相關，與FGFR3相關、TCGA評分呈負相關。見圖7
(4)IMS與ESTIAMTE算法
此外，經計算，高IMS組的腫瘤純度顯著高于低IMS組。低IMS組的ESTIMATE、免疫和間質評分顯著高于高IMS組。見圖8
STEP4 中樞基因的評估
(1)確定中樞基因
作者利用Cytoscape軟件的Cytohubba和MCODE功能，在黃色模塊中尋找10個最重要的中樞基因(B2M、CD274、HAVCR2、CD33、CD14、FOXP3、LY96、BTK、DYSF和CD300A)。隨后也分析了中樞基因可能涉及的通路，提示可能啟動膀胱癌細胞凋亡、EMT和ER激素信號通路，并抑制PI3K/Akt通路、TSC/mTOR通路、細胞周期、DNA損傷反應和AR激素，受體酪氨酸激酶(RTK)。圖9
(2)臨床意義分析
膀胱癌中Hub基因的表達，CR/PR組的CD274和B2M表達明顯高于SD/PD組。
(3)生存分析
B2M和CD274高表達患者的生存時間顯著長于低表達患者，而CD300A表達較高的患者生存時間較短。
(4)B2M與膀胱癌免疫浸潤的相關性
作者特別研究了B2M基因，
首先，免疫組化分析顯示B2M在腫瘤組織中的表達高于正常組織。
接著多色免疫熒光染色探索B2M之間的相關性和腫瘤微環境。量化B2M +細胞距離腫瘤組織不同距離梯度。（圖10）
量化了不同B2M+細胞濃度梯度內CD8+ T細胞和CD68+巨噬細胞的數量（圖11），并認為三者之間存在關聯性。
（5）拷貝數變異與免疫相關基因的表達
作者利用GSCALite web服務器挖掘公共癌癥基因表達和預后數據庫。使用該服務器分析11,160個TCGA樣本的多組學數據。對Hub基因mRNA在泛癌中的表達及其預后分析顯示，腎臟腎透明細胞癌(KIRC)中Hub基因高表達與總體獲益顯著相關，而在肺鱗癌(LUSC)中觀察到相反的趨勢。
STEP5 風險預測模型的構建與驗證
(1)構建模型
以黃色模塊基因為基礎，將IMvigor210隊列中的患者按7:3的比例隨機分為訓練組(244個樣本)和驗證組(41個樣本)。采用LASSO Cox回歸分析構建由CXCL13、ZYX、SPHK1、TLR2、MEFV、TNFSF14、UBD、LAG3 8個基因組成的風險預測模型。在模型驗證中，訓練組和驗證組中的高危組的死亡率明顯高于低危組；內部驗證集進一步驗證，得到了一致的結果。ROC曲線分析評估風險預測模型的敏感性和特異性，結果驗證所建立的風險預測模型的預測值(訓練集:1年AUC = 0.767, 3 / 5年AUC = 0.835;驗證集:1年AUC = 0.638, 3 / 5年AUC = 0.719）
(2)風險評分對患者預后的影響
單變量Cox回歸分析表明，使用PD-L1免疫抑制劑治療的膀胱癌患者的風險評分與較差的生存期相關，并且是較差OS的重要預測因子。多因素Cox回歸分析采用單因素Cox回歸分析中具有統計學意義的特征因素，風險評分為獨立的危險因素。
STEP6 風險預測模型的預后價值評估
進一步分析模型基因發現CXCL13和LAG3等基因在CR/PR中的表達顯著高于SD/PD ，而ZYX和TLR2的表達則相反。
（1）評估風險模型與24個免疫細胞之間的相關性。
8個風險預測模型基因與大多數免疫細胞顯著相關。風險預測模型基因與記憶B細胞、活化樹突狀細胞、靜息樹突狀細胞等呈正相關。提示這8個風險預測模型基因可能對免疫細胞浸潤有調節作用。值得注意的是CXCL13表達于卵泡輔助T細胞本身，并且包含在用于定義卵泡輔助T細胞亞群的基因集中。
（2）逐個基因分析
使用風險預測模型的生存分析顯示 SPHK1、TLR2和ZYX高表達患者的生存時間更短。然而，CXCL13、LAG3和UBD高表達組的生存時間明顯長于低表達組。
（3）重點基因分析
首先，免疫組化分析顯示，CXCL13在腫瘤組織中的表達高于正常組織。
接著，不同距離梯度下的腫瘤細胞數量，我們發現距離腫瘤細胞越遠，細胞總數和CXCL13+細胞數量逐漸減少（圖12）。
腫瘤癌巢中CXCL13+細胞數量(27.15%)遠低于腫瘤間質中CXCL13+細胞數量(72.85%)。離CXCL13+細胞越遠，CD8+T細胞和CD68+巨噬細胞的數量逐漸減少，這些結果表明，CXCL13+細胞可能與CD8+T細胞和CD68+巨噬細胞有積極的相互作用。
STEP7 風險預測模型基因的泛癌分析
（1）與免疫浸潤之間的關系
首先，作者發現這八個基因的變化可能會影響免疫細胞浸潤水平并且研究了30種癌癥中，發現在大多數癌癥中ZYX的表達受到CNV的顯著調控，其次是TLR2和SPHK1。我們分析了33種癌癥中每個風險預測模型基因的雜合/純合CNVs的組成。
（2）在正常組織與癌癥組織中表達是否存在差異
又比較了模型基因在腫瘤組織和正常組織中的表達，發現在腎透明細胞癌中所有風險模型基因表達的差異最大。SPHK1、UBD和LAG3在LUSC中的表達水平高于正常細胞，而TLR2、MEFV、ZYX和TNFSF14的表達水平則相反。
（3）對臨床亞型的影響
模型基因對臨床癌癥亞型的影響，對乳腺癌、腎透明細胞癌、肺鱗癌、肺腺癌是最顯著的。
（4）對信號通路的影響
在信號通路起始階段，模型基因主要啟動凋亡、EMT和激素信號通路;但它們在細胞周期、DNA損傷反應、AR和ER激素以及rtk中發揮抑制作用。
STEP8 建立預測生存的Nomogram
基于單因素和多因素Cox回歸分析結果，確定危險因素構建了包含10個獨立預后因素(β(X-m)項、風險評分、同源重組、免疫檢查點水平、fancori、免疫檢查點效應因子、DNA損傷修復基因、CD8+ Teff、TNB和TMB)，來預測免疫靶點抑制劑治療膀胱癌患者的生存率(圖13)。每個患者對每個預后參數進行評分，總評分表明該患者預后較差。此外，校準圖提示該模型具有與理想模型相似的性能。決策曲線分析(DCA)也得到了結果。
參考文獻：Chen, X., Xu, R., He, D. et al. CD8+ T effector and immune checkpoint signatures predict prognosis and responsiveness to immunotherapy in bladder cancer. Oncogene 40, 6223–6234 (2021). https://doi.org/10.1038/s41388-021-02019-6
