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大家好呀！今天給大家介紹一篇2021年11月剛剛發(fā)表在frontiers in Cell and Developmental Biology（IF：6.684）上的文章。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建了肝癌預(yù)后模型。
Development of an Autophagy-Based and Stemness-Correlated Prognostic Model for Hepatocellular Carcinoma Using Bulk and Single-Cell RNA-Sequencing
利用轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建自噬和肝細胞相關(guān)的肝癌預(yù)后模型
摘要：
越來越多的證據(jù)表明，自噬在惡性腫瘤形成過程中起到重要作用，自噬相關(guān)預(yù)后特征可用于預(yù)測高死亡率癌癥的預(yù)后。自噬相關(guān)基因參與肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但目前還不是十分了解自噬對肝癌的預(yù)后價值。本研究對ICGC和TCGA數(shù)據(jù)庫進行差異分析和差異分析，共鑒定到10個自噬相關(guān)基因，包括PC1、CDKN2A、RPTOR、SPHK1、HGS、BIRC5、SPNS1、BAK1、ATIC和MAPK3。隨后進行GO，KEGG功能富集分析，相關(guān)性分析，一致性聚類和PCA分析揭示自噬相關(guān)基因在治療HCC中的潛在作用。腫瘤干細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析表明這些基因與干細胞特性正相關(guān)。同時，作者使用單因素Cox，LASSO和多因素Cox回歸分析研究自噬相關(guān)基因，最終鑒定到ATIC和BIRC5是肝癌的預(yù)后標(biāo)志物。總的來說，作者鑒定到的10個自噬相關(guān)基因是肝癌的潛在治療靶點，ATIC和BIRC5可以準(zhǔn)確預(yù)測肝癌的預(yù)后。
流程圖：
材料和方法：
1.數(shù)據(jù)集預(yù)處理：從ICGC和TCGA數(shù)據(jù)庫獲取肝癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床病理特征，ICGC數(shù)據(jù)集包括正常樣本202例，腫瘤樣本243例，TCGA數(shù)據(jù)集包括正常樣本50例，腫瘤樣本374例。從GEO數(shù)據(jù)庫獲取HCC腫瘤的干細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE103866）。人類自噬數(shù)據(jù)庫（HADb）是第一個人類自噬專用數(shù)據(jù)庫，從HADb獲取232個自噬相關(guān)基因。
2.肝癌自噬相關(guān)基因的差異分析：使用limma對ICGC和TCGA數(shù)據(jù)集的腫瘤樣本和正常樣本進行差異分析，分別鑒定到25和54個自噬相關(guān)DEGs。
3.鑒定與預(yù)后有關(guān)的自噬相關(guān)差異表達基因和功能分析：使用ICGC和TCGA數(shù)據(jù)集的自噬相關(guān)差異表達基因進行生存分析，獲得10個與預(yù)后有關(guān)的自噬相關(guān)基因。隨后進行GO和KEGG富集分析。
4.單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：對HCC干細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，包括55個HuH-1細胞，63個HuH-7細胞和12個HCC細胞。
5.一致性聚類和PCA分析：使用一致性聚類將HCC樣本分為不同亞群。
6.構(gòu)建預(yù)后模型：使用單因素Cox，LASSO和多因素Cox回歸分析構(gòu)建預(yù)后模型。
結(jié)果：
1.鑒定肝癌中差異表達的自噬相關(guān)基因
對ICGC和TCGA數(shù)據(jù)集的正常樣本和腫瘤樣本進行差異分析，分別鑒定到25和54個差異表達的自噬相關(guān)基因（圖1）。
2.自噬相關(guān)DEGs的生存分析
為研究自噬相關(guān)DEGs的相關(guān)性和預(yù)后價值，作者對ICGC中的25個和TCGA中的54個自噬相關(guān)DEGs進行生存分析。ICGC中的14個DEGs和TCGA中的23個DEGs與生存期顯著相關(guān)。兩個數(shù)據(jù)集取交集則得到10個自噬相關(guān)基因（圖3A）。圖2A和2B是這10個自噬相關(guān)基因的生存分析。此外，作者發(fā)現(xiàn)這10個自噬相關(guān)基因的高表達與預(yù)后較差有關(guān)。
3.自噬相關(guān)基因的相關(guān)性分析和功能分析
相關(guān)性分析表明，這10個自噬相關(guān)基因相關(guān)性較強（圖3B），其在腫瘤組織中的表達水平高于正常組織（圖3C），說明這10個基因可能具有潛在的致癌作用。GO分析表明，這10個基因富集于自噬的特異性活性和過程（圖3D）。KEGG分析表明，這10個基因富集于非小細胞肺癌，黑色素瘤，凋亡和病毒性癌變等通路（圖3E）。
4.自噬和預(yù)后相關(guān)基因與EPCAM,CD24和PROM1正相關(guān)
CSCs是一種特異性細胞簇，與癌癥復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移和化療耐藥性有關(guān)，并且CSC的維持和分化也與自噬有關(guān)。因此，作者對兩種HCC細胞系的肝CSCs和肝癌患者的CSCs的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進行分析。歸一化后，包括130個single細胞和20個pool細胞，HuH7細胞與患者細胞的分布較為近似（圖4A和4B）。此外，pool細胞的測序深度高于single細胞（圖4A）。CSCs的標(biāo)記物分別在HuH-1，HuH-7和患者細胞中表達（圖4B-4D）。此外，EPCM,CD24和PROM1的表達水平與熒光激活細胞分選結(jié)果一致（圖4E）。使用UMAP對細胞進行降維得到2個細胞亞群。隨后，作者研究自噬相關(guān)基因在CSCs中的表達水平，大多數(shù)自噬相關(guān)基因在三陽性CSCs中高表達，表明自噬相關(guān)基因高表達可能會增強癌細胞的干性從而導(dǎo)致預(yù)后較差（圖4F）。為驗證scRNA-seq的結(jié)果，作者進一步研究這10個自噬相關(guān)基因與CSC標(biāo)記的相關(guān)性，這10個自噬相關(guān)基因與EPCAM，CD24和PROM1正相關(guān)（圖4H）。隨后，作者分析干性打分與10個自噬相關(guān)基因的相關(guān)性， ATIC,BIRC5和CDKN2A與HCC患者的干性打分正相關(guān)（圖4G），結(jié)果表明自噬相關(guān)基因與HCC干性有關(guān)。
5.一致性聚類分析和PCA分析表明10個自噬相關(guān)基因可以用于HCC患者分層
基于這10個自噬相關(guān)基因的表達水平對HCC患者進行一致性聚類分析，HCC患者分為兩個亞群（圖5A和5E）。此外，PCA分析表明HCC患者分為兩個亞群（圖5B和5F）。ICGC-1和ICGC-2的預(yù)后具有顯著差異（圖5C），TCGA-1和TCGA-2的預(yù)后同樣具有顯著差異（圖5G）。隨后，作者比較了兩個亞群的臨床病理特征差異，ICGC-2的10個自噬相關(guān)基因表達水平更高，分期更高并且生存情況較差（圖5D）。然而，TCGA-1的10個自噬相關(guān)基因表達水平更高，分期更高，生存情況較差并且腫瘤分期較高和等級更高（圖5H）。
6.構(gòu)建預(yù)后模型
由于這10個 自噬相關(guān)基因與HCC的預(yù)后具有較強的相關(guān)性，作者接下來研究這10個自噬相關(guān)基因的預(yù)后價值。首先，作者進行單因素Cox回歸分析，篩選到6個基因（圖6A）。隨后，作者進行LASSO分析和多因素Cox回歸分析，篩選到2個基因（圖6B）。使用這兩個基因構(gòu)建預(yù)后模型，風(fēng)險打分=0.04*ATIC+0.03*BIRC5（圖6C）。根據(jù)風(fēng)險打分中位數(shù)將HCC患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。高風(fēng)險組的預(yù)后較差（圖6D），ROC曲線的AUC分別為0.737和0.717（圖6E）。HCC患者的生存狀態(tài)和風(fēng)險打分如圖6F所示。
7.構(gòu)建列線圖
作者使用單因素和多因素Cox回歸分析研究臨床病理特征和HCC患者的相關(guān)性，結(jié)果表明性別，分期，復(fù)發(fā)和風(fēng)險打分是HCC患者的主要風(fēng)險因素（圖7A和7B）。DCA圖為風(fēng)險打分模型與臨床病例特征的比較（圖7C和7D）。基于風(fēng)險打分和臨床病理特征構(gòu)建列線圖，列線圖可以評估1年，2年和3年的生存情況（圖7E）。
結(jié)論：
總的來說，作者對ICGC和TCGA數(shù)據(jù)集的自噬相關(guān)基因進行分析。基于自噬相關(guān)基因構(gòu)建預(yù)后模型和列線圖可以準(zhǔn)確預(yù)測HCC患者的生存情況。這10個自噬相關(guān)基因可以作為HCC治療的潛在靶點，ATIC和BIRC5基因是HCC患者的預(yù)后相關(guān)因子。然而，還需要進一步的臨床試驗和實驗研究，進一步驗證預(yù)后模型的臨床應(yīng)用和潛在價值。
