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大家好呀，今天分享的文章題為通過對多種癌癥的單細胞數(shù)據(jù)分析揭示了腫瘤和正常組織之間的內皮細胞的差異，于今年一月發(fā)表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》（IF = 6.155）上，文章整合了6種癌癥的單細胞數(shù)據(jù)，讓我們一起學習一下吧！
一、摘要
內皮細胞（ECs）在腫瘤進展中起著重要作用。目前，抗血管生成治療的主要靶點是血管內皮生長因子（VEGF）通路。抗VEGF/VEGFR治療由于其對正常EC的作用，可能導致腎毒性和心血管相關的副作用。因此，有必要識別腫瘤EC特異性靶點，可應用于各種癌癥類型。本文整合了來自6種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，構建了一個多癌癥EC圖譜來解析腫瘤EC的特征。發(fā)現(xiàn)尖狀EC主要存在于腫瘤組織中，而很少存在于正常組織中。尖狀EC參與促進腫瘤血管生成和抑制抗腫瘤免疫反應。此外，腫瘤細胞、髓系細胞和周細胞是促血管生成因子的主要來源。在多種癌癥類型中，尖狀EC的高比例與不良預后相關。還發(fā)現(xiàn)了PSMA是非前列腺癌中尖端樣ECs的特異性標記物（流程圖：圖1）。
二、結果
1、多種癌細胞圖譜的構建
本文收集了6種癌癥類型的scRNA-seq數(shù)據(jù)，包括結直腸癌（CRC）、胃癌（GC）、肺癌LC、卵巢癌（OVC）、胰腺導管腺癌（PDAC）和腎細胞癌（RCC），對獲得的數(shù)據(jù)進行單細胞分析構建多癌細胞圖譜，其中包括來自83個腫瘤樣本和30個正常組織的220075個細胞，對其進行去批次和質量控制。根據(jù)標記基因將細胞分為13個不同的細胞簇：B細胞、漿細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、樹突狀細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞、單核細胞、NK細胞和周細胞（圖2）。
2、對scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的綜合分析揭示了腫瘤組織和正常組織之間EC組成的差異
作者從整合好的多癌癥細胞圖譜中提取EC，一共10277個ECs，并將其重新劃分為6個細胞亞群：動脈內皮細胞、靜脈內皮細胞、毛細血管ECs 1、毛細血管ECs 2、尖狀EC、淋巴EC。毛細血管ECs 1存在于各種組織中，而毛細血管ECs 2主要存在于腎臟中，可能是一種組織特異性的EC亞簇(圖3d)。在研究的所有癌癥類型中，尖狀EC主要存在于腫瘤組織中，而在正常組織中幾乎不存在。其他EC亞群在腫瘤組織和正常組織中不存在差異。
作者利用構建的多種癌癥單細胞圖譜作為背景基因集，使用CIBERSORTx算法對TCGA進行反褶積計算。為了檢驗反褶積計算的尖狀EC比例的準確性，分析了尖狀EC基因特征的富集評分與多種癌癥類型中尖狀EC比例之間的相關性，發(fā)現(xiàn)基因特征與尖狀EC比例呈正相關，表明尖狀EC比例的預測是基于尖狀EC中特異性基因表達。結果還顯示，在大多數(shù)癌癥類型中，腫瘤組織中尖狀EC的比例明顯高于正常組織，這與多癌scRNA-seq數(shù)據(jù)的結果一致。同樣，包括動脈EC、靜脈EC和淋巴EC等三個EC簇的比例，在多種癌癥類型的腫瘤組織和正常組織中也沒有差異。有趣的是，COAD、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、THCA等7種腫瘤中總ECs的比例均高于正常組織，這表明這些腫瘤組織中的血管生成更為活躍（圖3）。
3、尖狀EC代表一種活化的EC亞簇，可以促進腫瘤血管生成同時抑制抗腫瘤免疫反應
作者研究了尖狀ECs的分子特征，GSVA分析顯示尖狀ECs在Notch信號、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號、血管生成和蛋白分泌通路富集。表明尖狀ECs代表了一個活化的EC亞簇，促進腫瘤血管生成。毛細血管ECs 2在炎癥相關通路中富集，如炎癥反應和TNF-α信號通路。相比之下，毛細血管ECS 1可能處于靜息狀態(tài)。使用GSVA對尖狀ECs進行GO分析，發(fā)現(xiàn)參與鈣粘蛋白介導的細胞粘附負調控的基因集富集，表明尖狀ECs可能通過誘導血管通透性促進腫瘤細胞的生長。
本文通過細胞通訊分析研究尖狀ECs如何影響TME，在本研究的六種癌癥類型中，MIF-CD74在尖狀ECs和免疫細胞之間高度富集。最近的研究表明，MIF-CD74可以通過招募腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）或直接抑制T細胞活化來抑制抗腫瘤免疫反應。因此，尖狀ECs可能通過與多種免疫細胞的作用來抑制抗腫瘤免疫反應。在多種癌癥類型中，尖狀ECs與CD8+ T細胞之間呈顯著負相關，表明尖端樣ECs可能抑制CD8+ T細胞的浸潤。總之，尖狀ECs代表了一個活化的EC亞簇，它可能促進腫瘤血管生成，同時抑制抗腫瘤免疫反應（圖4）。
4、腫瘤細胞、基質細胞和髓系細胞是促血管生成因子的主要來源
TME具有高水平的促血管生成因子，如VEGF、胎盤生長因子（PlGF，由PGF編碼）、血小板源性生長因子（PDGF）和成纖維細胞生長因子（FGF）。因此，作者進行了細胞通信分析來確定這些促血管生成因子的來源。結果顯示，腫瘤細胞、成纖維細胞、髓系細胞和周細胞均可分泌VEGFA或PlGF。進一步分析顯示，腫瘤細胞和髓系細胞，包括巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞和樹突狀細胞，是VEGFA的主要來源，而周細胞是PlGF的主要來源（圖5）。
6、在多種癌癥類型中尖狀ECs的高比例與臨床結果較差相關
為了進一步評估尖狀ECs比例與患者總生存期的相關性，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中不同癌癥類型的患者按尖狀ECs比例（高或低）分為兩組進行生存分析。結果顯示，較高的尖狀ECs比例相關在LUAD、OV、STAD、CESC、KIRP、BLCA和UCEC等多個癌癥隊列中，臨床結果較差。(圖6)
6、 PSMA是非前列腺癌中尖狀ECs的特異性標記物
以上結果表明，尖狀ECs在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，可作為癌癥治療的潛在靶點。為了確保精確的靶向，作者系統(tǒng)地評估了尖狀ECs中的特異性膜標記物。CXCR4是尖狀ECs的常用標記物，其在尖狀ECs中的表達量高于其它EC亞群。然而，CXCR4在大多數(shù)免疫細胞中也有表達，因此它不是尖狀ECs的理想標記物。為了識別出針對尖狀ECs的更特異性的膜標記物，本文篩選了所有的膜分子。首先，篩選了在尖狀ECs中高表達的基因，然后通過查詢數(shù)據(jù)庫來選擇膜分子。結果表明，其含量特別高在尖狀ECs中表達的膜分子包括CA2、INSR、HTRA1、MCAM、CDH13、PLVAP、THY1、TNFRSF4、LAMA4、PXDN、FOLH1和EDNRB。比較它們在不同EC亞簇中的表達，發(fā)現(xiàn)FOLH1是唯一在尖狀ECs和其它EC亞簇中差異表達的。此外，只有不到5%的上皮細胞、免疫細胞、成纖維細胞和周細胞有FOLH1的表達。因此，本文提出前列腺特異性膜抗原（PSMA，F(xiàn)OLH1編碼）可以作為尖狀ECs的特異性標記物和治療靶點（圖7）。
三、小結
作者是如何整合6套癌癥單細胞數(shù)據(jù)的呢？
1、我們通過HGNChelper包更新了所有scRNA-Seq基因表達矩陣的基因符號。
2、使用Seurat中單個癌癥類型的基因表達矩陣生成了六個Seurat對象（過濾：排除少于200個基因的細胞，超過8000個基因的細胞，超過25%的線粒體基因和超過1%的hemoglobin基因的細胞）
3、將所有的Seurat對象合并，構造一個組合的Seurat對象。合并后的Seurat對象進行NormalizeData、ScaleData、Find Variable Features（選了2000個）和RUNPCA處理，接下來使用Harmony軟件包的RunHarmony函數(shù)對不同樣本的Seurat OB進行集成，并校正批處理效應。
4、使用Find Neighbors 和 Find Clusters函數(shù)在分辨率為3的情況下進行聚類，使用50個主成分進行分析并應用UMAP對細胞圖譜進行可視化。
本文整合了多種癌癥的數(shù)據(jù)，提取其中的EC細胞亞群進行研究，發(fā)現(xiàn)尖狀EC主要存在于腫瘤組織中，而很少存在于正常組織中。尖狀EC參與促進腫瘤血管生成和抑制抗腫瘤免疫反應。此外，腫瘤細胞、髓系細胞和周細胞是促血管生成因子的主要來源。在多種癌癥類型中，尖狀EC的高比例與不良預后相關。還發(fā)現(xiàn)了PSMA是非前列腺癌中尖端樣ECs的特異性標記物。本文的亮點在于：1、通過6種癌癥數(shù)據(jù)進行篩選分析，得出的結論更具有說服力；2、將單細胞數(shù)據(jù)當背景基因集對TCGA數(shù)據(jù)進行注釋，無論是在scRNA-seq數(shù)據(jù)的角度還是在bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的角度都比較了尖狀EC在腫瘤組織和正常組織中含量的差異；3、通過細胞通訊的分析確定了促血管生成因子的主要來源；4、通過尖狀ECs中的特異性膜標記物的篩選得到了作為尖狀ECs的特異性標記物和治療靶點。本篇文章對多套數(shù)據(jù)的整合處理方法也是非常完善的，我們可以學習其對多種癌癥單細胞數(shù)據(jù)的整合方法以及作者對于每一個得到的結論通過數(shù)據(jù)驗證的同時積極驗證這個結論在其他癌癥中是否會存在相同結論的思考問題方式。
參考文獻：Zhang J, Lu T, Lu S, Ma S, Han D, Zhang K, Xu C, Liu S, Gan L, Wu X, Yang F, Wen W, Qin W. Single-cell analysis of multiple cancer types reveals differences in endothelial cells between tumors and normal tissues. Comput Struct Biotechnol J. 2022 Dec 30;21:665-676. doi: 10.1016/j.csbj.2022.12.049 . PMID: 36659929 ; PMCID: PMC9826920 .
