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大家好，虎年春節快樂。各位小伙伴們近期是不是在工作之余關注冬奧會和搶購冰墩墩呢？但作為一名科研狗，有時間的話還是不要忘記跟蹤前言領域的學術進展情況吆！來吧，今天給大家分享的是2022年1月份發表在Nature communication（IF=14.9）上的一篇文獻，文章是利用單細胞測序探究前列腺癌上皮細胞的狀態，為剖析疾病發展及后續治療提供了堅實基礎。
Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states
人類原發性前列腺癌的單細胞分析揭示了腫瘤相關上皮細胞狀態的異質性
摘要：前列腺癌是全球男性中常見的第二大惡性腫瘤。為了描述前列腺癌腫瘤微環境特征，作者對前列腺活檢樣本、前列腺切除標本和局限性前列腺癌患者來源的類器官進行了單細胞RNA測序。作者發現以高雄激素信號狀態為標志的前列腺上皮細胞存在異質性，且在前列腺癌中富集，并確定了一群可能與前列腺癌發生相關的腫瘤相關細胞。與ERG+細胞相比，ERG-腫瘤細胞與周圍管腔上皮細胞表現出共同異質性，并可能引起常見的腫瘤微環境反應。最終，作者發現前列腺上皮類器官擁有與腫瘤相關上皮細胞狀態，并富含與其親本組織不同的細胞類型和狀態。本文結果提供了診斷相關的見解，并推進了與前列腺癌發生相關的細胞狀態的理解。
方法：
1.樣本來源：作者獲得6例前列腺癌患者活檢樣本，4例根治性前列腺切除術患者腫瘤樣本，4例配對樣本（含腫瘤組織和正常組織）；即：6例活檢樣本、8例根治性前列腺切除術腫瘤樣本、4例正常樣本。
2.單細胞RNA-seq：Seq-Well測序平臺。
3.WES：3例患者的腫瘤組織和配對的正常組織進行WES測序。
結果：
1.前列腺癌（PCa）樣本單細胞RNA測序概述和局限性前列腺癌主要細胞類型的鑒定
通過對樣本分析獲得21743個細胞，共鑒定出9種不同的主要細胞類型，通過特定的基因表達譜進行標記（圖1a，b），并對每個細胞群中差異表達前10的基因進行了熱圖分析（圖1c）。對11個患者細胞組成分析發現，每個樣本中均包含了所有主要細胞類型，上皮細胞占比最高（圖1d）。三類樣本類型之間無顯著差異（圖1e）。
圖1 前列腺癌樣本單細胞RNA測序概述和局限性前列腺癌主要細胞類型的鑒定
2.上皮細胞簇揭示了腫瘤細胞和周圍非腫瘤上皮細胞的異質性
為了確定與前列腺癌相關的上皮細胞轉錄狀態，作者通過聚類分析確定了20個細胞簇（圖2a）。表達KRT5、KRT15、KRT17和TP63的細胞簇（圖2b）和顯著上調基底上皮細胞（basal epithelial cells）特征評分的被鑒定為基底上皮（basal epithelial，BE）。鑒于腫瘤細胞主要表達KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1等LE細胞標記物，具有高LE評分的細胞既可以是腫瘤細胞，也可以是非惡性LE細胞（圖2b）。BE和LE特征圖還顯示出另外一群細胞群（簇5），稱之為其他上皮細胞（other epithelial cells，OE）（圖2a，c），具有較低BE和LE評分。作者發現在四個細胞簇中，ERG+腫瘤細胞ERG表達上調（圖2b）。這11個簇包括之前注釋的4個ERG+腫瘤細胞簇和7個ERG不表達的簇（將其注釋為ERG-negative（ERG-）腫瘤細胞）（圖2c）。與非腫瘤LE細胞相比，ERG-腫瘤細胞的特征是富集了至少一個已知的前列腺癌基因集，且高表達腫瘤標志物（如SPON2和PCA3）(圖2b)。
為了檢驗注釋方法是否準確識別每種上皮細胞類型，作者計算了每種細胞類型前10的生物標志物（圖2d）。BE細胞高表達基底上皮細胞標志物KRT5、KRT15、KRT17。OE群中排前10的標志物有PSCA、PIGR、MMP7、SCGB1A1和LTF，其中PSCA在前列腺癌中上調，SCGB1A1是肺細胞標志物。ERG+和ERG-腫瘤細胞和非惡性LE細胞均高表達腔內標志物KLK3、KLK2和ACPP。ERG+腫瘤細胞以表達ERG和PCA3、AMACR、TRPM8為特征，ERG-腫瘤細胞以表達PCA3和TRPM8為特征（圖2d）。
先前一項正常人前列腺單細胞研究發現了兩組其他的上皮細胞：以KRT13、SERPINB1、CLDN4和APOBEC2表達為特征的“丘細胞”（hillock cells）和以SCGB3A1、PIGR、MMP7、CP和LCN2表達為特征的“棒狀細胞”（club cells）。在本研究中雖未發現第一群細胞（hillock cells），但確實發現了一個獨特的群體，它與第二群細胞類似，占所有上皮細胞的6.5%，它表達PIGR、MMP7、CP和LTF（圖2d）。作者就假設這個上皮細胞簇代表了以前在肺和正常前列腺標本中描述過的club細胞。為了驗證這一假設，作者將一個正常的前列腺club細胞基因集投射到上皮細胞，發現club細胞評分高的細胞很大程度上與OE簇重疊（簇5）（圖2e）。此外，與其他細胞簇相比，該簇含豐富的club特征（圖2f）。
圖2 腫瘤細胞和主要上皮細胞類型鑒定
3.Club細胞和BE細胞有前列腺癌富集的LE樣細胞狀態且AR信號中上調
Club細胞在前列腺癌分析中尚未被確定。由于作者在前列腺癌樣本中只捕獲了club細胞，而沒有捕獲“丘細胞”細胞，假設club細胞可能與癌變有關，在某些細胞狀態下，前列腺癌club細胞可能被富集。為了驗證這一假設，作者將前列腺癌club細胞與之前健康對照研究中正常club細胞結合，檢測到6種具有不同轉錄組譜的細胞狀態（圖3a）。與正常樣本club細胞相比，前列腺癌club細胞表現出LCN2和SCGB3A1基因下調，以及LTF、AR和AR下游成員包括KLK3、KLK2、ACPP和NKX3-1上調（圖3b）。
對于這六個亞群來說，均存在不同的差異表達基因（圖3c），細胞簇0中前列腺癌club細胞中占45%以上，且前列腺癌Club細胞占比是正常club細胞的3倍以上（圖3d）。該簇特點是LTF、腔內標記物和AR通路下游基因KLK2、KLK3、ACPP、PLA2G2A和NKX3-1表達較高（圖3e），表明其處于腔樣和雄激素應答狀態。
細胞簇0中明顯上調的基因集是雄激素反應通路（圖3f）。接下來，作者測試這種前列腺癌富含的細胞狀態是否代表腔樣細胞狀態。作者發現與其他細胞狀態相比，細胞簇0的LE評分很高（圖3g）。作者比較了細胞簇0、其他聚類細胞和前列腺癌樣本中的LE和club細胞標記物表達水平，發現club細胞簇0比其他細胞狀態表現出LE標記物KLK2、KLK3、ACPP和NKX3-1的表達更高的情況（圖3h），且club標記物PIGR、MMP7、CP和LTF在所有club細胞中的表達顯著高于LE群體（圖3h）。總之，與正常前列腺club相比，前列腺癌club細胞具有更高的雄激素信號，并富集LTFhigh和NKX3-1high腔樣細胞狀態（圖3i）。
圖3 鑒定具有上調雄激素反應特征的前列腺癌富含的club細胞狀態
4.BE和LE細胞的整合鑒定了前列腺癌樣本中富含的腫瘤相關細胞狀態
腔內樣club細胞狀態的發現引導作者研究前列腺癌樣本BE細胞群中是否存在類似細胞狀態。因此，作者將前列腺癌樣本BE細胞（BE PCa）與正常樣本BE細胞（BE normal）進行整合，確定了9個細胞簇（圖4a），而所有9個細胞簇在BE PCa和BE Normal細胞中都有，細胞簇6在PCa樣本中顯著富集，而細胞簇4在正常樣本中富集（圖4b）。雄激素反應通路、雌激素通路、胰島素信號通路和C2CP相關的癌癥KEGG通路顯著上調（圖4d）。AR通路成員是細胞簇6的主要標志物（圖4e）。雖然在上皮細胞中BE簇6并沒有與其他BE細胞聚集，但作者推測BE細胞簇6可能代表了BE/LE細胞的中間狀態（圖4f）。BE細胞簇6中唯一顯著不同是腔內標記物高表達（圖4g），盡管與前列腺癌LE細胞相比，表達水平較低。此外，作者發現BE細胞簇6在雄激素反應和LE評分中顯著上調（圖4h），表明這種細胞狀態可能是一種與前列腺癌相關的腔樣狀態。
圖4 BE和LE細胞整合鑒定了前列腺癌樣本中富含的腫瘤相關細胞狀態
5.整合上皮細胞分析揭示前列腺癌樣本中AR信號上調
為了描述前列腺樣本中全部上皮細胞轉錄組特征，作者整合了所有前列腺上皮細胞和先前正常健康對照的前列腺上皮細胞（圖5a）。作者在所有三種主要類型的上皮細胞（LE、BE和club細胞）中鑒定了腫瘤和正常樣本之間的差異表達基因，發現FOS、JUN和PSAP是所有細胞中普遍上調的基因（圖5b）。在BE和club細胞中兩個前列腺癌富集的細胞與其他BE和club細胞相比，AR通路明顯上調。作者測試綜合數據集中AR表達，發現在前列腺癌上皮細胞中，21.4% BE、28.6%的club、52.7%的LE、43.2%腫瘤細胞為AR+，與正常樣本中相同類型的細胞相比顯著升高（圖5c）。作者還計算了所有細胞的雄激素反應通路評分，發現與正常樣本相比，前列腺癌樣本中三種主要上皮細胞類型AR信號上調（圖5c）。BE的AR得分僅與BE細胞簇6呈顯著正相關，club細胞AR打分與club細胞簇0呈顯著正相關（圖5d）。在RNA-seq數據集中，AR打分與BE細胞簇6和club細胞簇0呈正相關（圖5e），這也使作者確定了BE細胞和club細胞狀態，且它們雄激素反應和前列腺癌關系更密切。
圖5 前列腺癌和正常上皮細胞的整合揭示了由前列腺癌富集的BE和club細胞狀態驅動AR信號上調
6.ERG+腫瘤細胞轉錄組圖譜具有患者特異性，而ERG-腫瘤細胞與周圍LE細胞重疊
在所有上皮細胞聚類分析中，ERG+腫瘤細胞與非惡性LE細胞是獨立的，而ERG-腫瘤細胞與非惡性LE細胞更接近（圖2c）。作者首先分別分析了ERG+和ERG-腫瘤細胞的亞結構確定了不同細胞狀態（圖6a，b）。ERG+腫瘤細胞呈現患者特異性，而在ERG-腫瘤細胞中沒有這種模式，因為大多數ERG-腫瘤細胞不僅在一個患者中存在（圖6c）。作者觀察到ERG+腫瘤細胞與非惡性LE細胞有明顯不同，而ERG-腫瘤細胞與非惡性LE細胞沒有明顯區別（圖6d）。ERG-腫瘤細胞沒有觀察到患者特異性（圖6e）。在兩組數據集中，TMPRSS2-ERG融合狀態與ERG+腫瘤細胞評分顯著正相關，TMPRSS2-ERG融合缺失與ERG-腫瘤評分顯著負相關（圖6f）。這些結果支持腫瘤細胞的特征和使用ERG表達作為分類注釋腫瘤細胞。BE、LE和club細胞GSEA分析存在不同（圖6g）。
圖6 ERG+和ERG-腫瘤細胞的比較揭示了患者特異性細胞狀態和患者之間異質性
7.T細胞和基質細胞分析揭示了ERG-患者的共同信號轉導
ERG+和ERG-腫瘤細胞轉錄組差異表明，它們可能在腫瘤微環境中引起不同的反應。為了確定腫瘤相關免疫細胞，以及特定免疫細胞是否在ERG+或ERG-樣本中存在差異，作者分析了T細胞群，并根據差異表達基因確定了CD4和CD8 T細胞、Treg和NK細胞（圖7a）。然后，作者根據ERG狀態對T細胞進行分群，發現了兩個CD4 T細胞群。在發現的兩個CD4 T細胞集群中，CD4 T細胞群1在ERG+患者中富集（圖7b），并以高表達FOSB、FOS和JUN為特征。CD4 T細胞群2在ERG-患者中富集（圖7b），并以高表達CXCR6和DUSP4為標志（圖7b）。同樣，作者根據患者ERG狀態對基質細胞進行分群，并確定了包括內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞（圖7c）。在這三種基質細胞中，成纖維細胞在ERG+患者中富集（圖7d）。為了檢測ERG-和ERG+患者腫瘤細胞之間的差異可能驅動不同基質細胞群和免疫反應，作者在ERG-和ERG+腫瘤細胞、CD4 T細胞和基質細胞之間進行了GSEA分析，并計算了ERG-患者中顯著上調基因集的交集。在ERG-腫瘤細胞、CD4 T細胞和基質細胞中發現了14個上調基因集（圖7e）。對于club細胞，在ERG-患者中沒有發現顯著上調或下調的通路（圖7f）。ERG-患者中常見的14個上調基因集包括PD-1反應組和IFN-γ信號反應組（圖7g），據報道這兩種基因在晚期前列腺癌中均上調。CD4 T細胞、腫瘤細胞和基質細胞中HLA基因家族的表達明顯高于ERG+細胞群（圖7g）。
圖7 CD4 T細胞群與ERG狀態和ERG-腫瘤微環境中PD-1和IFN-γ信號通路上調有關
8.前列腺癌類器官中含有上皮細胞，在BE細胞和club細胞中具有獨特的擴張細胞狀態
為了建立模型來確定單細胞分析揭示的細胞狀態異質性，并確定是否可以重建和繁殖前列腺癌相關club細胞，作者使用已建立的方法從6名接受局限性前列腺切除術的患者單細胞中獲得局限性前列腺癌類器官，并在三次傳代內使用scRNA-seq對其進行表征分析?；趶那傲邢俳M織樣本和正常樣本中生成的細胞類型，共確定了6種上皮細胞（圖8a）。為了證實在類器官中恢復了細胞類型多樣性，對KRT8+腔細胞和KRT5+基底細胞進行了免疫熒光染色（圖8b），通過對SCGB1A1和LTF染色驗證club細胞體外增殖能力，該蛋白在scRNA-seq鑒定的前列腺癌club細胞中上調（圖8b）。為了測試類器官可以作為腫瘤組織模型的保真度，作者將早期傳代（P0-P3）類器官樣本中的細胞與來自類器官的4個根治性前列腺切除術樣本上皮細胞整合在一起（圖8c）。對于4種來自患者的類器官，與親本組織相比，只有少量腫瘤細胞被捕獲。然而“丘細胞”、MSCs和MKI67+上皮細胞只存在于類器官樣本中，在前列腺癌組織樣本中未觀察到（圖8d）。BE標記物KRT5、DST和KRT15在來自組織和類器官的BE群體中表達，而club細胞基因MMP7、LCN2和CP在兩個club細胞群體中均表達（圖8e），表明組織和類器官BE和club細胞之間存在相似性。類似地，當用前列腺癌組織中club細胞分析類器官club細胞時，作者發現共有8個獨特細胞簇，并在類器官樣本中觀察到細胞狀態擴展（圖8f）。相反，細胞簇7包括了ACPP、NKX3-1、KLK2和KLK3等LE標記，這與之前發現的前列腺癌富集的club細胞狀態特征相一致（圖8g）。
圖8 體外類器官樣本含有豐富的前列腺癌BE和club細胞狀態
結論：
總之，本文提供了局限性前列腺癌的單細胞轉錄組圖譜，以確定和突出與前列腺癌發生相關的多細胞環境和細胞狀態。研究結果為前列腺癌相關的上皮微環境和細胞狀態變化提供了見解，從而改善了前列腺癌的診斷。
參考文獻：
Song H, Weinstein H N W, Allegakoen P, et al. Single-cell analysis of human primary prostate cancer reveals the heterogeneity of tumor-associated epithelial cell states[J]. Nat Commun. 2022,13(1):141.
