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各位早上好吖，由于工作原因，小編近期對基因編輯產生了濃厚的興趣，雖然前幾年相關話題此起彼伏，從18年賀建奎教授因為對雙胞胎嬰兒進行非法基因編輯而獲刑，到2020年諾貝爾化學獎頒發給兩名開發了CRISPR/Cas9編輯技術的科學家，這項如同自帶熱搜體質的女明星般存在的技術，在科研界和社會上都引起了熱議。作為一枚單純的吃瓜群眾，雖然每次小編都忍不住直呼“這么神奇的嗎？？？”，但終究還是走馬觀花，沒有啃到瓜心！所以呢，今天大家就陪小編一起來揭開這位流量明星的神秘面紗吧。
基因編輯的發展史
一說到基因編輯，自然而然就會聯想到轉基因，其實這哥倆無論是從原理還是技術上，都有著本質的區別。轉基因技術是將可表達優良性狀的外源基因片段重組到生物體內，是對基因組做加法，而基因編輯則是對基因組本身定向地進行核苷酸序列的替換、敲除、插入等操作，難度更大，精準度更高，因此也被稱為“基因組的剪刀”。 如圖1所示，邱志超等人簡單總結了幾大基因編輯技術的發展線。其實，在20世紀70年代和80年代，就有科學家分別對酵母和小鼠的基因組做過靶向改變，但當時由于重復難度大、效率低，以及缺乏其他哺乳動物可培養的胚胎干細胞，并沒有引起太大的波瀾，直到鋅指核酸酶的出現。
基因編輯有三寶
基因編輯技術的核心是在感興趣的基因組序列創建位點特異性的DNA雙鏈斷裂(DSB)，靶細胞對DSB有兩種修復機制：非同源末端結合（NHEJ）和同源重組修復（HDR）。NHEJ不需要任何模板，修復蛋白直接將斷裂的DNA末端拉近，在DNA連接酶作用下重新結合，NHEJ修復機制出錯的概率比較高，可能會發生局部的InDels，使得基因喪失功能，這樣的基因編輯通常稱之為基因敲除。而當細胞核內存在與損傷DNA同源的片段時，就可能發生HDR，因此可以在要轉入的基因兩端加同源臂，將設計的外源基因插入到目的位點，這樣的基因編輯稱之為基因敲入。
目前，用來制造DSBs的三大核酸酶包括：鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALENs)和成簇規律間隔短回文重復系統(CRISPR-Cas)。ZFNs由Fok I限制性內切酶產生的非特異性DNA裂解結構域與決定其特異性的鋅指蛋白結構域共同組成，一個鋅指單元結合3-bp DNA，通過在目標區域5-6bp間隔序列的兩側設計兩個鋅指基序，Fok I核酸酶就可以在間隔序列內引入DSB，刺激DNA損傷修復機制。ZFNs技術的出現在一定程度上揭開了基因編輯發展的序幕，在很長一段時間內，ZFNs技術一直是創建位點特異性DNA結合蛋白和酶的唯一方法。但是構建一個特異的鋅指蛋白較為費時費力，而且成功率低易脫靶，細胞毒性大，再加之Sangamo Biosciences公司的壟斷，這種商業化模式使得很難將其作為一項常規的實驗室技術，這在某種程度上催生了第二代基因編輯技術TALENs。
TALENs簡單直接的設計為研究人員提供了又一個可選擇的基因編輯平臺，經濟高效性使其得到爆炸性發展。TALE蛋白首次在植物病原體黃單胞菌屬中被發現，包含一系列高度保守由33~35個氨基酸組成的重復單元，其第12和13位為兩個可變氨基酸(RVD)， RVD可以識別DNA四種堿基，并特異性結合DNA序列。將TALEs與二聚化后才能發揮功能的Fok I核酸酶融合在一起，就構成了TALENs。同ZFNs的三聯體結合相比，TALE-DNA結合重復序列的單堿基識別更具靈活性，但由于相同重復序列的廣泛存在，對重復TALE序列的克隆也提出了更高的技術要求。此外，該技術依賴上下游序列，存在脫靶現象，也有一定的細胞毒性，還有研究表明該技術在嚙齒類動物胚胎中效果較差。
CRISPR/Cas系統是目前在哺乳動物細胞中進行基因編輯的較為有效的一種技術，CRISPR廣泛存在于原核生物中，由一系列來自噬菌體或質粒DNA的間隔序列區和高度保守的重復序列區組成。CRISPR系統的序列特異性沉默依賴于crRNA和tracrRNA，CRISPR RNA (crRNA) 堿基對與tracrRNA (反式激活嵌合RNA) 形成一個雙RNA結構——sgRNA，引導cas9內切酶到互補的DNA位點進行切割。同ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9系統通過sgRNA 進行定位，對不同位置的識別僅需要調整sgRNA上前20個堿基，顯著降低了哺乳動物基因編輯的工具構建成本和時間。同時，CRISRP/Cas9系統核酸內切功能（Cas9）與定位功能（sgRNA）相互獨立的特征也與上述兩種基因編輯技術不同，只需要同時在細胞內表達Cas9 蛋白和多條sgRNA，即可在同一細胞中同時進行多個位點的基因編輯，明顯增加了編輯效率和研究應用范圍。此外，CRISPR/Cas9特異性識別的PAM (crRNA上的原間隔子相鄰基序)序列在哺乳動物基因組中廣泛存在，因此可編輯的位點也顯著增加。CRISPR/Cas9系統為生成合適的人類疾病動物模型提供了復雜和靈活的基因靶向工具，該系雖然具有較高的編輯效率及操作簡便和成本低廉等優點，但仍未擺脫脫靶效應。
路漫漫其修遠兮
有著”上帝的手術刀”之稱的基因編輯技術，目前已廣泛應用于植物培育、細胞動物模型的構建、癌基因和藥物靶點的篩選，在基因治療中也擁有巨大的發展前景，為單基因遺傳病、癌癥等疾病提供了新的治療方法。比如，最早的臨床試驗是利用ZFNs 技術編輯CCR5基因抵抗HIV，研究者從HIV 病人中提取T 細胞，干擾CCR5 基因的表達可以抗HIV 感染；TALENs被用來提高治療性CAR T細胞的療效；基于CRISPR/Cas9技術的案例更是數不勝數，Nguyen等人基于CRISPR/Cas13d系統，利用腺相關病毒AAV將其遞送至COVID-19感染患者的肺部，從而達到清除病毒的目的。相較于人類，基因編輯技術在農業上的應用更加廣泛，如通過基因編輯生產具有抗病性的小麥、無角的奶牛、肌肉含量更高的豬羊等可食用動物。
由于技術層面以及社會倫理的原因，現在基因編輯治療疾病仍處在臨床前或者臨床研究階段，還沒有真正獲批的基因治療藥物。畢竟，人體是相當龐大復雜的系統，對于每個基因的功能我們還尚未達到完全了解的地步，很難保證不會牽一發而動全身。不過，可以肯定的是基因編輯將繼續成為科研、商業和臨床醫學中廣泛應用的工具，對于其發展方向，我們大可不必為之過度擔憂，就像五條人的那首歌“當問題出現了再告訴大家”，有了問題，相關的法律法規才能不斷完善。況且，對于基因編輯，各國都堅守著一個共識：禁止對人類生殖細胞進行基因編輯，可遺傳的人類基因改造是生物與醫學研究人員不能觸碰并且要共同守住的倫理道德底線。
未來，基因編輯這把利劍的作用能發揮到何種程度，小編非常好奇，翹首以待！好了，今天的分享到此結束，have a nice day！
參考文獻：
1、Mashimo T. Gene targeting technologies in rats: zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Dev Growth Differ. 2014 Jan;56(1):46-52. doi: 10.1111/dgd.12110. Epub 2013 Dec 27. PMID: 24372523.
2、Carroll D. Genome Editing: Past, Present, and Future. Yale J Biol Med. 2017 Dec 19;90(4):653-659. PMID: 29259529; PMCID: PMC5733845.
3、Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405. doi: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004. Epub 2013 May 9. PMID: 23664777; PMCID: PMC3694601.
4、 昆明理工大學學報.基因編輯技術及其在疾病治療中的研究進展和應用前景.邱志超，李卓霏，石 宏. 2021年10月第５期第46卷. doi:10.16112/j.cnki.53-1223/n.2021.05.252.
