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鼠標點點點就能發27+，檸檬樹上檸檬果，檸檬樹下你和我！
哈嘍，大家好!你們見過全文只有2張圖的SCI嗎？還是IF 27+的那種！今天小編為大家帶來一篇今年11月發表在Molecular Cancer的單基因泛癌分析，題目為Hiding in the dark: pan-cancer characterization of expression and clinical relevance of CD40 to immune checkpoint blockade therapy，影響因子27分+！總以為純生信不好發了，單基因也沒有多大研究意義，泛癌分析好像也爛大街了……哎，眼瞅著別人純生信單基因泛癌分析又發27+，真的是檸檬樹上檸檬果，檸檬樹下你和我！
數據來源
老規矩，先看數據來源~不過這篇文章的數據來源好像有點獨樹一幟的風格，本文采用的是TCGA / TARGET / GTEx RNA-Seq聯合數據集，包括3個單獨數據庫的數據，如下：
1）TCGA：眾所周知，TCGA數據庫是目前最綜合最全面的腫瘤數據庫，收錄了來自20000個病人，33個癌癥的數據。包括患者的臨床樣本信息以及測序數據(包括基因組，轉錄組，表觀遺傳，蛋白組等各個組學數據)。
2）TARGET：2018年上線的新腫瘤數據庫，主要針對兒童腫瘤，包含RNA、WGS、WES、CNV、甲基化等測序結果，同時具有比較完整的臨床信息。
3）GTEX：第一個收集了多個人體器官mRNA測序的數據庫，包括來自449名生前健康的遺體捐贈者44個不同器官的測序數據，覆蓋面非常廣。
TCGA數據庫綜合全面、權威，但是缺點就是正常組織樣本的測序數據非常少；而GTEx可以非常好地彌補這個缺點，GTEx的最大優勢就在于正常組織樣本的測序數據非常多。相比于TCGA，TARGET針對的面窄了一些，但同時也意味著，它的內容更具針對性，同時也是一個比較新的數據庫，可以在一定程度上為文章注入新的血液，畢竟老生常談的那些常見生信數據庫也被挖掘的差不多了，如果這個時候在文章中增加一個新的數據庫，會讓讀者眼前一亮。本文的一大特色之處就是聯合使用這3個數據庫，兩兩互補，在經典的基礎上進行了創新。
結果解讀
本文雖然是27+的水平，但是它的結果部分卻非常簡單，僅僅只有2張組圖而已，小編今天就帶大家“看圖說話”。
1.CD40與1型抗腫瘤反應和良好預后有關
第一張組圖分3個小圖，主要講述了CD40的表達與I型抗腫瘤T細胞反應和生存率呈正相關。
圖1A是通過UCSC Xena網站獲取了TCGA/TARGET/GTEx這3個數據庫中正常和腫瘤組織中指定基因（下文會提到的一些與CD40相關的markers）的表達數據，并繪制了熱圖。這里有必要講一下“UCSC Xena”這個在線網站:它是一個對多種常用的生信數據庫的數據進行二次開發的衍生網站，收錄了TCGA、ICGC、TARGET、GTEx等多個數據庫的公共數據。相信對于很多做生信分析的小伙伴來說，并不是專業的“碼農”，所以無論是數據下載還是后期的數據處理，都是我們的一大痛點。而UCSC Xena正好解決了我們這個難題，這個在線網站基本上保留了原有數據庫的所有數據，還對數據進行了整理，我們可以直接下載使用，基本上能滿足我們做生信的大多數需求。在本文中作者就是通過UCSC Xena下載數據，并利用聯合數據庫中可用的轉錄組數據和相應的正常組織數據一共確定了23種癌癥類型，用于以下的研究。
圖1B分析了CD40 mRNA表達與其配體（CD40LG）以及一些markers的相關性，并繪制了秩相關矩陣，主要目的是為了分析CD40的表達與I型抗腫瘤T細胞反應的關系，這些markers主要是腫瘤中的一些免疫細胞、可能發生的反應以及細胞增殖與死亡的生物標記物。貼心的小編猜測你可能并不關心具體是哪些makers以及最終的結果，所以小編就用“需要用放大鏡才能看到的”字體展示了。
markers包括MHC（HLA-DRA），樹突狀細胞（BATF3），B細胞（PAX5），巨噬細胞（CD68），粒細胞（主要是嗜中性粒細胞，CD177），T細胞（CD4和CD8A），I型抗腫瘤反應（IFNG和GZMB），細胞增殖（MKI67），細胞死亡（BAX），細胞活力（正常（n = 8152）和癌癥（n = 10137）組織中的BCL2）和II型促腫瘤反應（IL5）。結果發現，CD40在正常組織和腫瘤微環境中均與CD40LG適度共表達。在正常組織中，CD40與I型反應（IFNG，r= 0.33;GZMB，r= 0.37）和抗原呈遞（HLA-DRA，r = 0.53），T輔助細胞Th（CD4，r= 0.41）呈正相關，而與細胞毒性T細胞（CD8A，r= 0.19）相關性不明顯。與細胞增殖（MKI67）最相關的是CD40LG（r = 0.61）和促凋亡標志物BAX（r = 0.56），這表明CD40/CD40LG軸在免疫細胞更新和體內平衡過程中具有重要作用。CD68（巨噬細胞）而不是CD177（嗜中性粒細胞），在正常（r = 0.42）和腫瘤（r = 0.38）組織中與CD40呈正相關。此外，CD68（巨噬細胞）與抗原呈遞反應高度相關（HLA-DRA，正常和腫瘤組織中的r = 0.71和0.60），并且與GZMB適度相關（在正常和腫瘤組織中分別為0.54和0.47）。在TME中，發現CD40表達與I型反應（HLA-DRA,r = 0.46），T細胞(CD4,r = 0.44;CD8A,r = 0.48)和APC反應(IFNG,r = 0.40;GZMB,r = 0.45)呈中度相關。此外，CD40與正常（r = 0.30）和腫瘤（r = 0.36）組織中的BATF3（樹突狀細胞）呈中度相關。相比之下，CD40LG與PAX5（B細胞，正常和腫瘤組織中的r = 0.45和0.46分別）適度相關，但與BATF3（樹突狀細胞）無關。在腫瘤中，APC標志物HLA-DRA（MHC分子），BATF3（樹突狀細胞），PAX5（B細胞）和CD68（巨噬細胞）與CD8A，IFNG和GZMB呈正相關（r>0.3）。總之，這些結果表明，雖然CD40 / CD40LG信號可能由APCs以上下文依賴性的方式介導的，但它與T細胞介導的細胞毒性作用（CD8A，IFNG和GZMB）有關。觀察到的CD40表達與I型抗腫瘤T細胞反應之間的關聯可能部分由TME中的CD40、CD8 T細胞引起，因為CD40激活是其記憶生成的基礎。CD40/C40LG與TME中的細胞死亡（BAX）或細胞存活（BCL2）標志物之間沒有相關性。此外，CD40/CD40LG軸與正常或癌組織中的II型促腫瘤反應（IL5）沒有相關性。
圖1C通過Xena平臺構建了以CD40四分位數分層的總生存Kaplan-Meier圖。
結果顯示，腫瘤中的高CD40表達與癌癥患者更好的生存率有關。
2.CD40靶向RAS/RAF/PI3K，與免疫治療相關
第二張主圖分5張小圖，主要描述了CD4在不同癌癥中的表達水平和相關的通路及其在免疫檢查點阻斷治療反應中的預測價值。
圖2A是在23種癌癥類型中分析了CD40的表達水平。
結果顯示，與相應的正常組織相比，CD40在11種惡性腫瘤中下調，包括腦癌，乳腺癌，肺癌，結腸癌，卵巢癌，食道癌，皮膚癌，前列腺癌，子宮癌，子宮內膜癌和血癌。而在5種惡性腫瘤（甲狀腺，睪丸，頭頸，腎上腺和腎臟）中CD40表達升高。
圖2B驗證了CD40在黑素細胞痣（簡稱“痣”）樣本中的表達，并使用NCBI-GSE112509據集將其與黑色素瘤組織中的表達進行了比較。
結果顯示，在NRASwt/BRAFwt 痣, NRASwt/BRAFmut 痣和 NRASwt/BRAFwt 黑色素瘤中，CD40的表達水平沒有顯著差異。但是，發現了CD40在具有致癌NRAS和BRAF突變的黑色素瘤組織中的表達異質性，與NRASwt/BRAFmut痣組織相比，CD40在NRASwt/BRAFmut黑色素瘤中表達減少。此外，與NRASwt/BRAFwt痣、NRASwt/BRAFmut痣或NRASwt/BRAFwt黑色素瘤組織相比，NRASmut黑色素瘤中CD40表達降低。
圖2C在TCGA數據庫中的Firehose Legacy黑色素瘤數據集(n=479)進一步分析了CD40在不同突變類型黑色素瘤中的表達。
結果發現，RAS (N/H/K)突變單獨(p=0.058)或與NF1突變聯合(p=0.038)，與黑素瘤中CD40表達減少相關。這些結果與先前報道的“抑制RAS/RAF/PI3K通路增加黑色素瘤細胞中CD40表達”的結果非常吻合。
圖2D通過NCI數據庫(一個經過校對的權威通路互作數據庫，http://www.ndexbio.org/)分析了CD40的互作通路。
結果顯示，CD40/CD40LG軸可能導致MAPK，PI3K / AKT，NF-κB和JAK3 / STAT5途徑的激活。
圖2E通過TIDE數據庫評估了CD40預測不同腫瘤免疫治療效果的價值。作者分析了CD40表達的ROC曲線下面積(AUC)，并將其與現有的生物標志物(包括腫瘤突變負荷(TMB)、CD274 (PD-L1)和CD8)進行比較，判斷其作為預測免疫治療反應工具的潛力。TIDE數據庫全稱是Tumor Immune Dysfunction and Exclusion，翻譯為中文就是腫瘤免疫功能障礙和排斥，網址為http://tide.dfci.harvard.edu/，主要用來推測調節腫瘤免疫基因的功能，綜合分析免疫功能障礙和排斥對腫瘤的免疫逃逸機制，從而來有效預測免疫檢查點抑制治療的效果
結果顯示，在≥50%的黑色素瘤隊列和一個胃癌隊列中，CD40的預測性能與CD8相當，這兩個生物標志物的AUC >0.7，預測免疫治療陽性反應的可能性很強。值得注意的是，CD40 是唯一在預測膠質母細胞瘤 ICB 反應方面取得良好性能的生物標志物（AUC = 0.83）。 TMB (AUC = 0.73) 和 CD274 (AUC = 0.7) 分別在一個膀胱癌隊列和一個 HNSC 隊列中可以預測 ICB（免疫檢查點阻斷）反應。值得注意的是，在用α-CTLA4或α-PD1治療的兩個黑色素瘤患者隊列中，高CD40與更好的總生存期（OS）相關。然而，接受α-PD-L1治療的膀胱癌患者或接受α-PD1治療的腎癌患者中，CD40與OS沒有特別顯著的相關性。
結語
好了，到這里“看圖說話”就結束了，我們回頭總結以下，為什么這篇文章的圖文這么簡單，卻還能發27+呢？小編認為有以下2點：
（1）選題非常好，貼近熱點，具有較高的臨床意義：免疫檢查點抑制劑 (ICB)的腫瘤治療只有一部分人可以長期獲益，如果能夠準確預測具體哪些患者可以獲益，將會推動醫學發展的巨大進步。
（2）聯合多種數據庫，內容更全面:作者不僅采用TCGA等常見的數據庫，還利用一些比較新的數據，數據庫之間相互彌補，相互印證，結果更可靠。
參考文獻:
Yan, C., Richmond, A. Hiding in the dark: pan-cancer characterization of expression and clinical relevance of CD40 to immune checkpoint blockade therapy. Mol Cancer 20, 146 (2021). https://doi.org/10.1186/s12943-021-01442-3
