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由于缺乏腦成纖維細胞，很多人認為惡性膠質瘤中不存在癌癥相關成纖維細胞（CAFs）。今天給大家介紹一篇剛剛發表在JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION（IF：19.456）的文章，作者通過12例膠質母細胞瘤患者的單細胞RNA測序和空間轉錄組數據，確定了CAF和膠質母細胞瘤干細胞的相互作用。
膠質母細胞瘤(GBM)是一種侵襲性腦癌，預后差。中樞神經系統中缺乏纖維母細胞，因此許多人推測GBM缺乏CAFs，但一些研究已經確定了在GBM中表達CAF標記的細胞。然而，這些研究未能全面描述這些細胞及其對GBM及其微環境的影響。更重要的是，這些研究依賴于細胞表面標記，而沒有全面的基因表達譜，這增加了被識別的細胞可能是微環境中的其他細胞的可能性，例如周細胞，毛細血管壁中的細胞與成纖維細胞共享重疊的細胞表面標記。
作者對GBM患者樣本進行了5周的胰蛋白酶化，去除較少的粘附腫瘤細胞，從而保留對胰蛋白酶化具有抗性的細胞，這些細胞已被證實為其他癌癥中的CAFs。開發了一種分類器方法(VAMPIRE)，來對這些細胞的形態進行量化，以分類和比較不規則的細胞和核形狀。VAMPIRE區分GBM細胞和CAFs的準確度為91%。相比之下，當患者GBM樣本在沒有連續胰蛋白酶化的情況下進行培養時，GBM細胞占主導地位，將具有CAF形態的細胞群減少到18%（圖1A，B），這說明連續胰蛋白酶化產生了富含CAFs的細胞群。
Bulk RNA-Seq顯示，GBM中的這些CAFs樣細胞表現出與乳腺CAFs相似的轉錄組特征，但與周細胞不同，周細胞的形態和表面標記物表達與CAFs重疊(圖1C)。將這些CAFs樣細胞與來自8種組織的正常成纖維細胞進行比較，發現這些細胞與真皮成纖維細胞最相似(圖1C)。總的來說，這些發現支持了這些細胞是GBM CAFs的假設。
為了嚴格評估從患者GBM中分離的這些細胞的轉錄組譜和純度，作者對其中4385個細胞進行了scRNA-Seq。從GBM分離出的大多數細胞中不存在與CAFs具有某種譜系的細胞表達的標記，包括上皮細胞標記物EPCAM、平滑肌細胞標記物SMTN和內皮細胞標記物PECAM1。
之后，對這4,385個連續胰蛋白酶化細胞排除了表達細胞表面標記的非CAF基質細胞，將其定義為上皮細胞、內皮細胞、周細胞或免疫細胞。在其余75.2%的細胞中，穩定表達CAF標記物的轉錄物，包括ACTA2和COL1A1。然后，根據5種非CAF標記物的缺失及其上述CAF標記物的表達程度，計算了通過對GBM患者進行連續胰蛋白酶化分離得到的單個細胞的CAF評分(圖1D)。CNV分析顯示，在連續胰蛋白酶化分離的細胞中，大多數具有高CAF評分的細胞缺乏染色體改變，而一些具有可變CAF評分的細胞表現出7號染色體的增加和10號染色體的丟失，這是GBM的標志(圖1E)。從CAF評分高的細胞中篩選這些顯示7號染色體增加和10號染色體丟失的細胞，發現通過連續胰蛋白酶化分離出的患者GBMs細胞中52%為CAFs，22%為髓系細胞，20%為惡性細胞，6%為少突膠質細胞(圖1F)。
接著作者進行了偽時序分析，揭示了早期CAF群體進化為2種CAF亞型，并計算了從早期到晚期GBM CAFs的不同表達譜(圖1G，H)。這些發現與乳腺癌研究一致，表明表達ACTA2的CAFs代表了癌癥中分化程度更高的CAF亞型。
為了確定是否可以在患者GBMs的scRNA-Seq中識別CAFs，作者分析了12例患者GBMs的scRNA-Seq結果。發現簇的最佳數量由簇穩定性評分決定，結果在每個患者中看到18個穩健的細胞簇(圖2A)。
UMAP圖顯示腫瘤細胞和基質細胞緊密分組(圖2A)，CNV分析顯示腫瘤細胞顯示7號染色體增加和10號染色體丟失，腫瘤相關基質細胞無染色體畸變(圖2B)。計算了單個細胞的CAF分數，12例患者中的每一例都存在CAFs。值得注意的是，具有高CAF評分的細胞簇沒有表現出CNV(圖2C)。
然后，確定了鑒定的這些CAFs是否具有與胰蛋白酶化分離的scRNA-seq中分離的細胞相同的早期和完全分化的亞型。從GBMs患者中鑒定為CAFs的細胞中提取早期與晚期的偽時間依賴基因，結果顯示，雖然通過連續胰蛋白酶化分離的細胞含有早期和完全分化的CAF亞型的混合，但GBMs患者大多含有完全分化的CAF亞型(圖2D)。
在GBM的4種惡性細胞狀態中，CAFs與間充質樣(MES-like)特征在空間上最相關(圖2E-G)。CAFs與M2促腫瘤巨噬細胞距離較近，與小膠質細胞和神經元基因標記距離較遠(圖2G)。CAF也與表達膠質母細胞瘤干細胞(GSC)標記CD44的細胞非常接近(圖2H)。由于CAF與表達CD34或CDH5的內皮細胞的接近，從而在GSC所在的血管周圍壁龕中富含。
由于GBM CAFs位于靠近腫瘤啟動GSCs的血管周圍生態位，作者分析了GBM CAFs對GSCs的影響。從GBM6細胞中提取含有GSC的神經球，并在GBMpt3CAFs (CAF_CM)的條件培養基（CM）中培養72小時。利用NanoString nCounter平臺和770基因多重PanCancer progression panel對這些細胞進行轉錄組評估，并與對照神經球介質(NM)中的GBM6神經球進行比較，分析癌基因的表達。分析顯示，GBM CAF分泌組上調了癌癥進展途徑，包括HIF-1α、EMT和GSCs中的細胞增殖(圖3A，B)。
然后，作者進行了限制性稀釋神經球形成實驗，發現與NM相比，GBMpt5CAF CM中GBM6衍生的GSC頻率增加，GBMpt5CAF CM在不同稀釋度下也增加了GBM6神經球的產量(圖3C，D)。
為了識別CAF對GSC影響的介質，使用GBM CAFs和GBM6衍生神經球的RNA-Seq結果，通過將GSC受體的表達映射到CAF細胞表達的同源配體/激動劑的表達，創建了推斷的交叉對話資源(圖3E)。在從GSC-CAF受體配體分析中鑒定候選基因時，選擇骨橋蛋白(OPN)及其受體CD44和肝細胞生長因子(HGF)及其受體c-Met。在抗OPN或抗HGF中和抗體的存在下進行了神經球形成實驗。GBMpt5CAF CM增加了GBM6神經球的總面積，這說明了神經球的數量和大小，抗HGF或抗OPN減輕了這一影響。聯合抗HGF和抗OPN抗體也減少了GBM6和GBM43球的形成(圖3G)。這些結果表明，CAFs誘導的神經球形成的增加是通過OPN-CD44和HGFcMET軸介導的。
根據空間轉錄組學結果(圖2,E-H)，假設GSCs可能將CAFs招募到GBM的血管周圍生態位。作者評估了CAFs對GSC CM的跨基質趨化反應(圖4A)。發現GSC CM吸引的GBMpt1CAFs是NM的5倍(圖4B)。相比于它們在NM中的缺乏生長，CAFs在GBM43細胞或GBM6細胞衍生的GSC CM中生長得更多(圖4C)。
然后，為了研究這些GSC對CAFs影響的潛在介質。重點研究了PDGF和TGF-β，因為它們都出現在GSC CAF配體-受體分析中(圖4D)。TGF-β中和抗體在2.5 ~ 10 μg/mL時對侵襲無抑制作用(圖4E)。就GSC誘導的CAF增殖的介質而言，抗PDGFB的中和抗體和抗TGF-β的中和抗體并沒有改變GBM43 GSC CM誘導的CAF增殖，而聯合這些抗體可減少GBM43 GSC CM誘導的CAF增殖(圖4F)。
然后，在非莖貼壁的DBTRG-05MG細胞中添加GBMpt1CAF CM不改變MES基因表達。通過形狀因子評估，GBMpt1CAF CM也沒有改變形態，基質腔侵入，或增殖的非莖貼壁GBM6細胞。這些結果表明，GBM CAFs對GSCs的原性作用是特異性的。
RNA-Seq分析顯示，纖維連接蛋白(FN;FN1基因) 在GBM CAFs中相對于周細胞有差異表達，由于FN是GBM中最豐富的ECM蛋白，進一步分析了CAF FN1的表達。GBM的FN1表達高于非腫瘤腦樣本。GBM也比低級別膠質瘤有更高的FN1表達。定量PCR顯示相對于TAM和腫瘤細胞，CAFs中的總FN增加了32倍，EDA剪接變體增加了16倍，這表明EDA是一種比其他CAFs的細胞表面受體更特異性的GBM CAF生物標志物(圖5A)。轉錄組分析還顯示，患者GBM中EDA的表達與MES亞型基因CHI3LI、TIMP1和SPOCD1的聚集表達呈正相關，預后較差(圖5B)。
當在培養的HUVECs中進行功能檢測時，發現將GBMpt4CAF CM添加到沒有GBM細胞的培養的HUVECs中，增加了血管生成3個階段中的前2個階段，尖端細胞的網絡擴張和小管形成，而不影響第三階段(圖5C，D)。這表明CAFs對內皮細胞具有直接的血管生成作用，而不是由GBM細胞增強。
然后，作者研究了CAFs對巨噬細胞的影。與缺乏EDA剪接變體的血漿FN相比，GBMpt2CAF CM和它們產生的FN的EDA剪接變體導致從外周血分離的人單核細胞衍生的培養巨噬細胞產生更多的M2極化(圖5E)。同樣，當THP-1單核細胞分化為巨噬細胞，然后在GBMpt2CAF CM中孵育時，GBMpt2CAF CM比已知的細胞因子陽性對照更能驅動M2極化(圖5F)。在循環人單核細胞來源的培養巨噬細胞中誘導的M2極化GBMpt2CAF CM被抗EDA FN受體TLR4的阻斷抗體逆轉(圖5G)。
為了評估不同腫瘤區域的CAF水平，作者從患者GBMs的不同區域獲得了定點活檢。沿側腦室側壁發現的大腦中最大的生發區，它容納了神經干細胞，當腫瘤累及該區域時，該區域會產生GSCs(圖6A)。腦室下區（SVZ）樣本的EDA表達增加了22倍，FN表達增加了22倍，但相對于腫瘤核心，EDB表達僅增加了5倍(圖6B)。免疫熒光也顯示SVZ GBM富集EDA FN(圖6C)。通過流式細胞儀檢測表達α-SMA的細胞，SVZ GBM也得到富集，4.9%的腫瘤核心細胞表達α-SMA，而SVZ GBM細胞表達α-SMA的細胞為13.4%(圖6D)。在未涉及SVZ的GBM患者尸檢的SVZ樣本中未出現EDA染色(圖6E)。
為了確定CAFs對GSCs的原作用是否也發生在體內，作者將40,000個GBM6神經球細胞顱內植入，并將35,000個GBM6神經球細胞與5,000個GBMpt3CAFs混合植入無胸腺小鼠。在大多數小鼠中，含有神經球的CAFs能夠使腫瘤生長達到終點，而沒有CAFs則不會發生這種情況(圖7A)，這說明CAFs對GSCs的促腫瘤作用也發生在體內。事實上，向35,000個GBM6神經球細胞中添加5,000個GBMpt3CAFs，會導致擁有35,000個GBM6神經球細胞的小鼠與擁有100,000個GBM6神經球細胞且沒有CAFs的小鼠在同一時間點到達終點，這些結果揭示了CAFs在體內對GSCs促瘤作用的程度。
在終點分析這些腫瘤時發現，培養中發現的GBM CAFs對微環境的原作用也發生在體內。通過NanoString nCounter平臺對體內與CAFs一起生長的GBM6神經球衍生的腫瘤進行轉錄組分析，與在體內未生長CAFs的GBM6神經球相比，顯示HIF-1、EMT和細胞增殖途徑基因上調(圖7B-D)。腫瘤血管免疫熒光顯示，CAFs導致GBM6神經球來源的腫瘤表現出總血管面積/高倍場(hpf)增加(圖7E，F)。此外，流式細胞術顯示，CAFs增加了GBM6神經球源性腫瘤中CD206+ M2前巨噬細胞的百分比(圖7G)。
首先，作者量化了9例新診斷的GBMs中非上皮細胞、內皮細胞、周細胞或免疫細胞，但在scRNA-Seq中至少表達5種CAF標記之一的細胞的百分比。平均而言，這些腫瘤中12.3%的細胞缺乏非CAF基質標記，但至少表達5種CAF標記中的1種。考慮年齡和性別的多變量Cox回歸顯示，以這種方式確定的生存與CAF水平之間沒有相關性。其次，使用TCGA數據集發現，當腫瘤表現出高表達的ACTA2，以及其他5種CAF標記(FAP、PDPN、DES、THY1或S100A4)中的任何一種高表達時，新診斷的GBM患者的生存惡化。
在GBM中缺乏CAFs的主要論點是，除了血管中有少量CAFs外，大腦中沒有成纖維細胞。然而，由于有證據表明，其他腫瘤中的CAFs來自骨髓來源的前體，CAFs可能存在于GBM中似乎是合理的。事實上，研究已經確定了在GBM中表達與CAFs相關標記的細胞。作者首先對膠質母細胞瘤標本進行連續胰蛋白酶化處理，得到具有CAF形態和單細胞轉錄組譜的細胞，這些細胞缺乏拷貝數變異(CNVs)。在12例膠質母細胞瘤患者的單細胞RNA-Seq中鑒定出無CNVs和高CAF評分的細胞。偽時間重建顯示，未成熟的CAFs演化為亞型，成熟的CAFs表達ACTA2。空間轉錄組證實CAF接近間充質膠質母細胞瘤干細胞(GSCs)、內皮細胞和M2巨噬細胞。CAFs被GSCs趨化吸引，CAFs使GSCs富集。通過將受體的表達映射到它們的同源配體，確定PDGF和TGF-β是GSC對CAFs的影響的介質，骨橋蛋白和HGF是CAFs誘導的GSC富集的介質。CAFs通過產生結合巨噬細胞TLR4的EDA纖維連接蛋白變體來誘導M2巨噬細胞極化。
