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3步？純生信？就這也能發6+？
哈嘍，大家好，今天小編向大家分享一篇發表在Journal of Cellular Physiology雜志（IF 6.384/Q2）上的純生信文章，為了保持神秘感，小編先不透露這篇文章的主要研究內容哈，不過友情提醒“老”生信人扶好下巴，小心驚掉哦~同時呢，小編也想和那些沒有生信基礎，還在觀望狀態準備上手生信分析的小伙伴說，get生信分析技能，發SCI不是夢！言歸正傳，上干貨！
背景介紹
自身免疫性肝炎(AIH)是一種以慢性肝臟炎癥、界面性肝炎、血清免疫球蛋白 γ升高和非器官特異性自身抗體產生為特征的免疫介導的肝細胞損傷性疾病。非特異性免疫抑制是目前的標準治療方法。AIH的一個顯著特征是肝臟中存在T輔助細胞1(Th1)產生的干擾素- γ(IFN-γ)。一些研究表明 BALB/c 具有純合 Tgfb1 缺陷的小鼠自發地迅速發展為 Th1 介導的 IFN-γ 依賴性壞死性炎癥性肝病，從而建立了暴發性 AIH 模型。
研究方法
1.數據來源
GSE9892：GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
WT：野生型小鼠
Tko：Tgfb1缺失的小鼠
ITko：Tgfb1和Ifng缺失的小鼠
一個樣本取自一只小鼠，每個基因型包含三只小鼠。
(小編理解：“ko”為knockout縮寫，T為Tgfb1縮寫，IT為Tgfb1和Ifng縮寫)
2.分析流程
1)差異表達基因的鑒定：GEO2R在線工具，p <0 .05和|倍數變化|≥1.5被定義為差異表達基因(DEGs)
2)功能富集分析：使用Cytoscape與插件CluGO(版本2.5.4)
3)免疫細胞浸潤的評估：CIBERSORT在線網站
結果展示
Part 1. 哼！誰還不會基因差異表達分析呢？
圖1a 小提琴圖展示了這9只小鼠所有基因的表達分布。
圖1b 展示了這三種基因型兩兩比較后篩選出的上調DEGs和下調DEGs。
圖1c-e 可視化每組比較的前50個DEGs。
Part 2. 這？不就是最簡單的功能富集分析？
小編絞盡腦汁，思前想后，終于get到了作者的思維邏輯：“總-分”
第一個“總-分”結構
作者通過三種基因型兩兩比較后篩選出了一堆兒DEGs，生信分析的套路不就是先篩選出一堆兒的差異基因，然后通過一系列的手段和方法，不斷縮小選擇范圍，從而獲得幾十個甚至幾個自己“最中意”的目標基因嗎嗎？其中最常用的一種方法就是“取交集—Veen圖”，聰明如小編的作者同樣采取了這種做法~
1.1“總”：三種基因型共同DEGs的功能富集分析
圖2a 展示了三種基因型兩兩比較后獲得的516個共同DEGs。
圖2b 通過和弦圖展示了每組比較之間DEGs的相互關系。
圖2c GO功能富集分析：這些DEGs在生物過程中顯著富集，包括對干擾素-γ的響應和先天免疫反應的正向調節。相互關系分析表明，生物過程可分為幾組，其中細胞對細胞因子刺激的反應、免疫反應的調節和先天免疫反應是富集的前三組。
圖2d KEGG信號通路富集分析：白細胞介素-1信號，免疫應答蛋白的磺?；?，通過ZBP1的放射免疫沉淀介導的核因子κB活化是最顯著富集的途徑之一，相關性分析顯示CD3和TCR zeta鏈的磷酸化、免疫系統、磷脂在吞噬作用中的作用、白細胞介素信號、葡萄糖代謝、與趨化因子受體結合的趨化因子是顯著富集的途徑。
1.2“分”：與WT組相比，Tko組DEGs的功能富集分析
圖3a Tko組中表達上調(2451個)和表達下調(2894個)的DEGs。
圖3b 上調基因的GO功能富集分析：刺激反應的正調控、白細胞活化、免疫系統過程的（正)調控、定位調節和先天性免疫反應是最豐富的生物過程。
圖3c 下調基因的GO功能富集分析：富集的生物過程主要分為代謝過程，包括有機酸代謝過程、脂質代謝過程和輔助因子代謝過程。
圖3d 上調基因的KEGG信號通路富集分析：PD-1信號轉導、Toll樣受體級聯、免疫系統中的細胞因子信號轉導、干擾素-γ信號轉導和基因表達/轉錄是分類最多的通路。
圖3e 下調基因的KEGG信號通路富集分析：大多富集在細胞周期、免疫系統、脂類/甾體代謝和生物氧化等途徑。
1.3“分”：與WT組相比，ITko組DEGs的功能富集分析
圖4a ITko組中表達上調(2744個)和表達下調(1929個)的DEGs。
圖4b 上調基因的GO功能富集分析：T細胞活化、細胞過程的正向調控、白細胞活化/遷移、細胞因子產生的調控、免疫系統過程的調控歸為最重要的生物過程。
圖4c 下調基因的GO功能富集分析：富集的生物過程主要分為代謝過程，包括有機酸代謝過程、脂質代謝過程和輔助因子代謝過程。
圖4d 上調基因的KEGG信號通路富集分析：大多富集在Rho GTP酶信號傳遞、免疫系統、Fc-γ受體依賴的吞噬作用和免疫系統中細胞因子信號傳遞等通路中。
圖4e 下調基因的KEGG信號通路富集分析：在脂質/甾體/氨基酸的代謝、化合物的一期功能化、生物氧化劑和免疫系統等途徑中顯著富集。
第二個“總-分”結構
一頓操作猛如虎，細心的讀者就能發現，分析了那么多，卻還沒有真正進入正題，那正題是啥呢？不就是“自身免疫性肝炎--AIH”嘛！所以接下來自然而然的就要圍繞主題開展分析了，果不其然，第二個“總-分”結構踏著輕盈的步伐朝我們走來了~
2.1“總”：與AIH緩解相關DEGs的功能富集分析
圖5a 與AIH 緩解相關的下調DEGs：Tko vs WT獲得2451個上調基因，ITko vs Tko獲得1004個下調基因，取交集得472個共同DEGs。
圖5b 與AIH 緩解相關的上調DEGs：Tko vs WT獲得2624個下調基因，ITko vs Tko獲得1911個上調基因，取交集得586個共同DEGs。
圖5c 上調基因的GO功能富集分析：這些基因在免疫反應調控方面顯著富集，可分為對其他機體的反應、防御反應的調控、免疫系統過程/免疫反應的調控和對細胞因子的反應/調控等。
圖5d上調基因的KEGG信號通路富集分析：這些基因主要富集在免疫系統通路中，顯著富集的組別包括干擾素信號轉導、IFN刺激基因的抗病毒機制、(適應性)免疫系統和葡萄糖代謝。
圖5e 下調基因的GO功能富集分析：細胞-細胞信號轉導、管發育和神經系統發育最顯著富集
圖5f 下調基因的KEGG信號通路富集分析：細胞外基質組織、含TSR域蛋白的O-糖基化和跨化學突觸的傳遞是富集度最高的途徑。
2.2“分”：Tko小鼠和ITko小鼠特異性上調基因分析
圖6a Tko小鼠和ITko小鼠特異性上調DEGs：Tko vs WT獲得1141個上調基因，ITko vs WT獲得1434個上調基因。
圖6b Tko小鼠上調DEGs的GO功能富集分析：顯著富集在對細胞因子的反應、解剖結構形態發生、防御反應、免疫系統過程的調控和多細胞機體過程的調控等。
圖6c Tko小鼠上調DEGs的KEGG信號通路富集分析：總富集的通路主要可以歸納為免疫系統、免疫系統中細胞因子信號轉導、白細胞介素的信號轉導、止血、趨化因子受體結合趨化因子。
圖6d ITko小鼠上調DEGs的GO功能富集分析：這些基因大多參與的途徑主要可歸納為（有絲分裂）細胞周期過程、有絲分裂核分裂的負調控、（微管）細胞骨架組織、蛋白質定位到染色體、DNA復制獨立的核小體組裝。
圖6e ITko小鼠上調DEGs的KEGG信號通路富集分析：基因顯著富集在包括細胞周期、有絲分裂前分裂、核包膜分解、驅動蛋白和Emi 1的磷酸化等通路組中。
2.3“分”：Tko小鼠和ITko小鼠特異性下調基因分析
圖7a Tko小鼠和ITko小鼠特異性下調DEGs：Tko vs WT獲得1713個下調基因，ITko vs WT獲得748個下調基因。
圖7b ITko小鼠下調DEGs的GO功能富集分析：大多富集在多細胞生物體發育、細胞通信調節、細胞大分子代謝過程和突觸組織等。
圖7c ITko小鼠下調DEGs的KEGG信號通路富集分析：這些基因在免疫系統、GPCR信號傳遞、線粒體翻譯終止、磷酸肌苷-3激活的AKT信號傳遞和細胞對應激的反應等通路組中顯著富集。
圖7d Tko小鼠下調DEGs的GO功能富集分析：這些基因顯著富集在有機酸/羧酸/脂質代謝過程、細胞對化學刺激的反應以及參與與共生體相互作用的宿主細胞的自噬。
圖7e Tko小鼠下調DEGs的KEGG信號通路富集分析：總富集通路主要可分為氨基酸及衍生物代謝、Toll樣受體級聯、鉬輔基生物合成、COPII介導的囊泡運輸和糖胺聚糖代謝等。
Part 3. 嗐！最終還是避免不了蹭熱點：免疫細胞浸潤分析
看了前兩部分的分析，你是不是和小編一樣心中充滿大寫的不服氣，就這？也能發6+？說來說去，看似分析了很多內容，其實不就是選擇不同的對照組，重復的進行差異表達基因(DEGs)和GO/KEGG富集分析嗎？技術含量趨近0。不過，在文章的末尾，終于看到了已經不算是熱點的“熱點”了[笑哭]。
我們姑且信了作者所說的，為了深入了解不同條件下免疫細胞的組成，才進行了免疫細胞浸潤分析，用到的還是在線的CIBERSORT分析工具[笑哭]。
免疫細胞豐度如圖8a所示，Tko組的T細胞、巨噬細胞和自然殺傷（NK）細胞增加，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞和B細胞顯著減少。與Tko組相比，ITko組巨噬細胞和NK細胞減少，T細胞、嗜酸性粒細胞和漿細胞增加。又如圖8b所示，CD4 T細胞是T細胞的主要類型。盡管有些變化并不顯著，但觀察到CD4 T細胞和CD8 T細胞的免疫狀態從幼稚轉變為記憶的趨勢（圖8c）。此外，還觀察到輔助性T細胞的亞群轉移和巨噬細胞的表型轉移（圖8d）。
結語
至此，全文結束。額…說實話，小編在完整閱讀這篇文獻之前，還想著6+的純生信，純生信哎！沒有實驗驗證，總得有新奇的分析思路或者復雜的分析方法吧？讀完以后才發覺，也不過爾爾哈哈哈哈！所以說呢，咱們生信人就要有生信人的樣子，不怕沒思路，不怕技術不到家，只要有想法，就要去嘗試，哪怕只是掌握了最簡單的分析方法，努力去做，發SCI還不是信手拈來的事情？
調侃歸調侃哈哈，作者利用這么簡單的分析方法就能夠發IF 6+的SCI 論文，還是有其值得學習的地方的，我們正常情況下都會選擇人類來源的數據，而作者獨辟蹊徑，選擇AIH小鼠模型的微陣列數據，這也為我們以后的數據選擇提供了參考。其次，其研究在某些程度上也是具有重要意義的，作者全面揭示了該疾病所涉及的潛在生物學過程。發現AIH的發展與顯著增加的免疫反應和急劇抑制的代謝過程有關。通過估計免疫細胞的浸潤，發現了幾種類型的免疫細胞的失調，為理解AIH的發展提供了一個新的視角，這將有利于制定針對該病的有效治療策略。
參考文獻:Yu K, Yang J, Xie W, Wu F, Wang M, Li N. Integrated bioinformatic analysis revealed biological processes and immune cells implicated in autoimmune hepatitis. J Cell Physiol. 2021 Jul;236(7):5411-5420. doi: 10.1002/jcp.30246. Epub 2021 Feb 17. PMID: 33595095.
