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大家好，今天給大家介紹一篇今年4月份發表在nature communications（IF=12.556）上的文章。
An integrated multi-omics analysis identififies prognostic molecular subtypes of non-muscleinvasive bladder cancer
一項綜合的多組學分析確定了非肌肉浸潤性膀胱癌的預后分子亞型
摘要
非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)的分子景觀具有很大的生物學異質性和不同的臨床結果。在這里，我們對診斷為NMIBC的患者(n = 834)進行了綜合多組學分析。轉錄組學分析確定了四類(1,2a, 2b和3)，反映了腫瘤生物學和疾病侵襲性。除了既定的預后臨床病理參數外，轉錄組基礎的分型和染色體不穩定性水平都提供了獨立的預后價值。高染色體不穩定性、p53通路中斷和APOBEC相關突變與轉錄組2a類和不良預后顯著相關。RNA介導的免疫細胞浸潤與染色體不穩定腫瘤相關，富集于2b類。空間蛋白質組學分析證實了較高的2b類腫瘤浸潤，并證明了較高的免疫細胞浸潤和較低的復發率之間的關聯。最后，使用單一樣本分類工具在1228個驗證樣本中記錄了轉錄組分類的獨立預后價值。該分類器提供了一個框架，生物標志物發現和優化治療和監測下一代臨床試驗。
二、結果
NMIBC中轉錄組分類的描述
本文分析了535例患者的RNA-Seq數據(397 Ta, 135 T1, CIS)。使用非監督共識聚類的基因表達值限制在4000個變異最大的基因在整個數據集，確定了四個轉錄組類別。然后使用多變量Cox回歸分析，經臨床EORTC風險評分(歐洲癌癥研究和治療組織24)和EAU(歐洲泌尿外科協會)風險評估調整后，高危2a和2b類與PFS和RFS較差獨立相關。轉錄組學分類與各種臨床病理參數顯著相關。使用Lund系統進行分類顯示，91%的腫瘤被歸類為UroA，4%的腫瘤被歸類為基因組不穩定(GU)，后者大多出現在2a類。與NMIBC類相關的生物過程分析揭示了從分子分類和結果中區分經典組織學特征的重要信息。1類和3類腫瘤與早期細胞周期基因相關。此外，3類腫瘤的特征是FGFR3共表達基因高表達和免疫環境缺失。相反，2a類腫瘤大多與晚期細胞周期基因、DNA復制、蛋白和參與細胞分化的基因相關，從而表明分化和增殖不顯示負相關。此外，2b類腫瘤主要與腫瘤干細胞標志物的表達相關和參與EMT的基因，但與細胞增殖的相關性較小。然后本文通過RNA-Seq數據的反褶積來估計免疫細胞的存在。2b類腫瘤的總免疫浸潤評分明顯高于其他類腫瘤，提示免疫細胞浸潤水平高。為了進一步探索NMIBC類別之間的轉錄組差異，本文分析了23個預先確定的轉錄因子(即調控因子)的轉錄調控網絡(即調控因子)，這些轉錄因子先前研究了MIBC和癌癥中與染色質重構相關的候選調控因子。這種分析提供確認的生物相關性四個亞型分類,作為調節子活動是高度相關的轉錄組類。
根據病理特征分層的轉錄組亞型
為了減少病理和形態學差異引起的生物學混淆，本文對T1高級別腫瘤(n = 101)進行了亞分析。對T1低級別腫瘤進行非監督共識聚類分析，將基因表達值限制在2000個變異最高的基因上，確定了三種亞型:一個較大的組(T1HG- 2)，富集于1、2b和3類腫瘤，具有較高的早期細胞周期和FGFR3共表達基因和相對較好的結果，以及兩個較小的2a類腫瘤亞型。
然后構建了一個單樣本T1HG分類器，對535個腫瘤進行了分類。T1HG亞型與PFS顯著相關，多變量Cox回歸分析顯示，T1HG-1與臨床EORTC和EAU風險評分調整后的PFS和RFS較差獨立相關。
染色體不穩定與高危NMIBC有關
為了進一步研究NMIBC的基因組異質性，本文使用illumina SNP陣列對473對腫瘤白細胞進行了分析。基因組丟失/獲得和等位基因不平衡來自原始片段的總拷貝數和B等位基因頻率值。EORTC風險評分分層腫瘤的基因組圖譜分析顯示了類似的異常模式，但基因組(除了9號染色體丟失)在EORTC高危腫瘤中更常見。因此，腫瘤被分層為3個相同大小的基因組類(GC1- 3)，隨著CNA負荷的增加，以說明低、中、高染色體不穩定性。基因組分類與PFS和RFS顯著相關。重要的是，將生存分析局限于EORTC風險評分高的腫瘤，基因組類仍與PFS顯著相關。基因組分類與分期、分級、伴隨CIS和EORTC風險評分顯著相關。
整合基因組改變和轉錄組類
對303個腫瘤的基因組和轉錄組數據的整合分析顯示，轉錄組分類與基因組分類顯著相關。2a類腫瘤占GC3的比例最高(68%)。為了進一步證明這種關聯，本文發現基因組類別與基因qPCR進展風險評分之間存在強相關性(n = 449)，進展評分較高的腫瘤主要為2a級和2b級。當只分析2a類和2b類腫瘤時，基因組類仍然與PFS顯著相關，所有進展事件均與GC3腫瘤相關。基于RNA-Seq數據，稱具有中等或高功能影響的單核苷酸變異(SNVs)。2a類腫瘤的SNVs數量明顯高于其他所有類。與DNA測序相比，基于RNA-Seq數據的突變調用有幾個局限性，如果沒有參考種系比較，則有在分析中包括種系變異的風險。本文比較了38例患者的腫瘤和種系的RNA-Seq和全外顯子組測序(WES)，發現在我們所呈現的基因列表中，每個樣本和跨樣本使用的過濾方法顯著富集了體細胞SNV。此外，疾病驅動基因的拷貝數改變(來自SNP微陣列分析)被突出來進行比較，并表明CDKN2A總體丟失，PPARG和E2F3在2a類中顯著增加，RB1在2a類中丟失。值得注意的是，42%的腫瘤中p53通路改變，與高CNA負荷顯著相關和2a類腫瘤。TP53在17個腫瘤中同時受到拷貝數變化和點突變的影響。DNA損傷修復基因突變與RNA衍生的突變負荷顯著相關。此外，我們發現GC3腫瘤中的突變負荷和免疫細胞浸潤顯著升高。此外，本文推斷出7個三核苷酸單堿基突變信號，其中4個信號與之前在膀胱癌中發現的信號具有高度相關性，SBS1(年齡相關)，SBS2和SBS13(與過量的APOBEC活性有關)和SBS5(與ERCC2突變有關39)。在APOBEC相關標記的背景下，2a類腫瘤有明顯更多的突變。
腫瘤和免疫細胞的空間蛋白質組學分析
為了在空間水平上解決上述免疫特征，對167個腫瘤進行了多重免疫熒光和免疫非組織化學分析，其中有其他組織可用。我們分析了免疫細胞(T輔助細胞、TCL、Treg、b細胞、M1-和M2巨噬細胞;使用自動圖像分析算法41研究免疫細胞的空間組織和免疫逃避機制。150例腫瘤的RNA-Seq數據可用，RNA衍生的免疫評分與腫瘤實質中浸潤免疫細胞的水平顯著相關。不同的淋巴細胞亞群主要同時存在于間質和腫瘤實質。因此，只有少數腫瘤屬于免疫排除表型。因此，我們關注的是位于腫瘤實質的免疫細胞浸潤的程度，因此稱為免疫浸潤。值得注意的是，高免疫浸潤的腫瘤顯示MHC I類高表達。只有少數腫瘤在腫瘤實質中表達PD-L1，大多數腫瘤呈高度炎癥。蛋白質組水平的浸潤免疫細胞水平與轉錄組分類顯著相關，2b類腫瘤表現出最高的免疫浸潤。盡管炎癥2b類腫瘤的總體侵襲性特征，高免疫浸潤與較低的復發率顯著相關。很少有進展事件來證明這種對PFS的影響。此外，在基因組背景相似的腫瘤患者中顯示出一種可能的保護性免疫反應(很少有基因組改變)，在本組中，高免疫細胞浸潤患者的RFS較低免疫細胞浸潤患者長。以前在尿路上皮樣B腫瘤中也觀察到基底樣和發光樣標記物的共同表達。CK5/6陽性細胞部分與轉錄組組相關，其中轉錄組組3對CK5/6表達的富集最強。
綜合預測模型、分類器構建和獨立驗證
對所選的臨床特征和分子變量的單因素Cox回歸分析。此外，本文采用logistic回歸模型(n = 301)進行受試者工作特征(ROC)分析來預測5年內的進展。總的來說，每個轉錄組有不同的臨床特征、分子特征和腫瘤微環境。
最后將分類器應用于14個獨立隊列，包括3個未發表的數據集，共1228例患者的腫瘤通過廣泛的平臺進行分析。值得注意的是，與微陣列分析相比，RNA-Seq平臺更適合調用3類腫瘤。總體而言，本文發現FGFR3和TP53中腫瘤分級與腫瘤分期、腫瘤分級與突變之間存在高度顯著相關。且分級顯示出顯著不同的PFS，其中2a類腫瘤患者預后最差。
為了進一步驗證UROMOL2021分類器，本文比較了發現隊列與獨立隊列之間的調節活性和生物途徑富集的差異。規則和路徑分析證明了數據集之間的高一致性，支持了類的穩健性。
小結
作者以轉錄組為切入點，聯合了基因組、蛋白質組，對非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)進行了一系列的分析。首先在轉錄組層面將NMIBC分為了四個類，反映了腫瘤生物學和疾病侵襲性，除了既定的預后臨床病理參數外，轉錄組基礎的分型和染色體不穩定性水平都提供了獨立的預后價值。并發現了高染色體不穩定性、p53通路中斷和APOBEC相關突變與轉錄組2a類和不良預后顯著相關。RNA介導的免疫細胞浸潤與染色體不穩定腫瘤相關，富集于2b類。空間蛋白質組學分析證實了較高的2b類腫瘤浸潤，并證明了較高的免疫細胞浸潤和較低的復發率之間的關聯。最后，使用單一樣本分類工具在1228個驗證樣本中記錄了轉錄組分類的獨立預后價值。
