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癌癥已經成為威脅人類生命健康的關鍵因素，探尋治療癌癥的腳步從未停止。近些年，免疫治療已成為癌癥治療研究的新熱點，生信人在各大平臺上推出了很多相關報道。然而，以往大多數研究都是以T細胞作為預測PD1/PD-L1的標志物，今天給大家分享一篇2022年3月14日發表在Cancer Cell（IF:31.743）上，利用腫瘤內漿細胞預測非小細胞肺癌中PD-L1阻斷劑治療療效的文章。接下來讓我們一起看看如何使用漿細胞預測治療療效以及預測效能是怎樣的呢？

Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer

瘤內漿細胞預測非小細胞肺癌中PD-L1阻斷劑的治療療效

一．研究背景

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。80%至85%的肺癌屬于非小細胞肺癌（NSCLC）亞型。NSCLC的PD1/PD-L1阻斷具有比較良好和持久的療效，可顯著提高患者生存率。然而，大多數NSCLC患者對PD1/PD-L1阻斷的單一藥物治療沒有反應。阿替唑珠單抗（Atezolizumab）是一種針對PD-L1的單克隆抗體，可破壞PD-L1:PD-1和PD-L1:B7-1的相互作用進而達到治療的作用。在PD-L1高表達、T效應細胞激活、IFN-γ相關基因高表達和高腫瘤突變負荷（TMB）的腫瘤中觀察到Atezolizumab的具有更好的治療效果。然而，仍然需要了解應答和非應答患者中的浸潤免疫細胞的不同作用以及其他的生物學差異。在多個研究工作中，已經清楚地闡述了浸潤的CD8⁺ T細胞和免疫檢查點抑制劑治療的反應之間的關系。最近的研究發現，在黑色素瘤、軟組織肉瘤和腎細胞癌患者的腫瘤中，B細胞浸潤增加、三級淋巴結構（TLS）的存在與免疫治療反應改善之間也存在著比較強的關聯。重要的是，這些研究發現，無論采用何種治療方式，表現出高表達B細胞基因特征的腫瘤患者均顯示出良好的預后。因此，目前尚不清楚腫瘤內B細胞是否在PD1/PD-L1阻斷治療的情況下可以改善預后，或者是否可以成為轉移性NSCLC PD1/PD-L1治療的預后的預測標志物。

二．研究方法

該工作分析了來自POPLAR（phase 2）和OAK（phase 3）的891例治療前腫瘤的bulk RNA-seq數據，這兩項隨機臨床試驗分別是在NSCLC中進行了Atezolizumab免疫治療與Docetaxel化療的療效比較。在這兩項試驗中，首先確定了與Atezolizumab治療的患者總體生存（OS）益處相關的顯著的B細胞和漿細胞特征。然后，利用NSCLC的單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）數據集來識別腫瘤內濾泡B細胞、生發中心B細胞和漿細胞的轉錄組特征，并通過質譜流式檢測技術（CyTOF）在蛋白質水平上進行驗證。在bulk RNA-seq數據集中，對這些B細胞特征的反卷積強調了在Atezolizumab治療中，漿細胞可獨立于CD8⁺ T細胞信號而改善OS。最后，腫瘤內漿細胞的富集與TLS聚集的存在顯著相關性，并且具有TLS和/或LAs的腫瘤患者具有更好的預后。該研究揭示了在PD-L1檢查點阻斷治療中具有較好預后的 NSCLC患者中，存在比較強的腫瘤內B細胞和漿細胞的信號，并且獨立于CD8⁺ T細胞的存在。

三．研究結果

1、Atezolizumab治療患者的B細胞轉錄特征與改善的OS相關

在OAK隊列中，對Atezolizumab治療有OS改善和無OS改善的患者進行差異表達基因分析。 受益患者中高表達的基因主要是與B細胞和漿細胞相關的基因，例如CD19、 D79A、 ANK1、 CHAIN、 ZB1和TNFRSF17（圖1A），與細胞毒性T細胞和干擾素（IFN）相關的基因，例如CD3E、CD3D、CD3G、CD8A、GZMA-B、IFNG和CXCL9-10，然而，這些基因在Docetaxel化療組中均不顯著（圖1B），表明這些B細胞和漿細胞基因對Atezolizumab治療的應答具有預測價值。然后，在OAK隊列中進行生存分析，用三分位數對基因表達進行分類，并比較高表達（T3）和低/中表達（T1-T2）組中的生存曲線。B細胞標記物CD79A和CD19的高表達比IFNG或IFN誘導的趨化因子CXCL10更多地改善了OS（圖1C-F）。該研究還在蛋白質水平上確認這些轉錄組水平的研究結果，使用多重免疫熒光（IF）對Atezolizumab的兩名應答者和兩名無應答者的腫瘤樣本進行CD8、CD79和Ki67染色評估。與無應答的患者相比，在有應答的患者的腫瘤中檢測到大量CD79⁺ B細胞。

2. 在scRNA-seq轉錄組數據中鑒定B細胞亞群

為了進一步研究與Atezolizumab應答相關的B細胞，該工作分析了從44例NSCLC患者的肺和外周組織收集208506個細胞的scRNA-seq數據集。確定了三個主要CD79A⁺ B細胞亞群，包括濾泡B細胞、生發中心B細胞和漿細胞（圖2A）。雖然發現與正常鄰近組織相比，腫瘤組織中的B細胞和漿細胞數量增加，但這些B細胞群中的生發中心B細胞、濾泡B細胞和漿細胞的組成在同一患者的腫瘤和癌旁組織之間是相似的（圖2B）。濾泡B細胞高表達CD83、CD69、SELL和BANK1。漿細胞高表達多種免疫球蛋白轉錄物（IGHG2、IGHGP和IGHA2）、MZB1、DERL3和XBP1。生發中心B細胞高表達HMGA1、AICDA和RGS13（圖2C）。并且在兩個獨立的NSCLC scRNA-seq數據集中驗證了濾泡B細胞、生發中心B細胞和漿細胞的存在（圖2D和2E）。并進一步使用CyTOF在蛋白質水平上進一步證實了這三個B細胞亞群的存在。

3. 將scRNA-seq衍生的特征用于bulk RNA-seq分析

探究從scRNA-seq分析中確定的B細胞特征是否可以預測Atezolizumab治療或Docetaxel化療后的患者生存率。首先通過測量基因共表達并對這些共表達模式進行分層聚類，驗證了來自scRNA-seq的B細胞特征可以應用于bulk RNA-seq數據（圖3A）。為了進一步驗證特征，在23例NSCLC腫瘤上進行了配對bulk RNA-seq和多重IF（mIF）（圖3B）。總的來說，mIF或RNA-seq對漿細胞的定量具有高度相關性（圖3C）。重要的是，通過最高三分位數（T3）與底部兩個三分位數（T1-T2）對樣本進行二分，產生了高度相似的分層（圖3D）。此外，漿細胞RNA-seq標記基因單獨與mIF漿細胞定量相關，而與濾泡B細胞和生發中心B細胞標記基因則不相關，突出了漿細胞特征的特異性（圖3E）。總之，證明了scRNA-seq衍生的特征對漿細胞具有高度特異性，足以應用于bulk RNA-seq對樣本進一步進行分層。

4. 高漿細胞特征預測Atezolizumab治療后的患者生存率

使用三分位數對患者進行二分類，并比較T3和T1/2組。Kaplan-Meier分析顯示，雖然Atezolizumab在三個B細胞特征中觀察到OS改善的趨勢，但只有漿細胞信號顯著（圖4A-4D）。重要的是，無論是生發中心B細胞、濾泡B細胞，還是tGE8特征（IFNG、 CXCL9、CD8A、GZMA、GZMB、CXCL10、PRF1和TBX21）在這些模型中都不顯著（圖4E）。在研究隊列中，207名患者（Atezolizumab n=99；Docetaxel n=108）采用PDL1 IHC、RNA seq和組織TMB（FMI tTMB）進行了全面的生物標記物分析。為了評估漿細胞特征與免疫檢查點抑制劑治療反應已知生物標志物相比的預測價值和獨立性，將這些特征結合在多因素Cox比例風險分析中，發現漿細胞特征對Atezolizumab治療組中的OS有最強的影響。在Docetaxel化療組中沒有這些相關性，這突出了漿細胞特征的特異性，對Atezolizumab治療患者有益，但對化療無效（圖4F）。并且，漿細胞特征高的腫瘤患者僅在Atezolizumab治療組中臨床獲益率顯著增加（圖4H）。在OAK中分離鱗狀和非鱗狀NSCLC患者時，兩種組織學中漿細胞特征得分最高的三分位患者顯示Atezolizumab治療比Docetaxel化療具有更長的OS（圖4G）。

5. 漿細胞特征在具有三級淋巴結構(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的腫瘤中富集

研究發現H&E定義的TLS以CD20⁺ B細胞為主的獨特生發中心為標志。生發中心被CD20⁺ B細胞和CD3⁺ T細胞的混合物包圍，其中的CD3⁺T 細胞主要由CD8^-（CD4⁺ T細胞）和CD8⁺ T細胞兩種細胞構成（圖5A）。此外，所有已識別的TLS都由鄰近的漿細胞標記（圖5A）。LAs有更多的混合特征，沒有明顯的CD20⁺ 特征，富集更多的CD3⁺ T細胞而不是CD20⁺ B細胞（圖5A）。在LAs內或周圍也發現了漿細胞（圖5A）。通過mIF實驗證實了漿細胞與T細胞浸潤具有比較強的相關性。總之，這些數據表明，在TLS和/或LAs中，漿細胞浸潤可能與T細胞浸潤有關。因此，在POPLAR隊列中評估了腫瘤的H&E是否存在TLS和/或LAs。在分析的254例患者樣本中，9%的患者有TLS樣結構伴有生發中心，21%的患者有LAs，但未觀察到生發中心，其余70%的患者未檢測到TLS或LAs。Atezolizumab治療或Docetaxel化療組樣本之間的TLS或LAs分布沒有差異（圖5B）。含有TLS和/或LAs的腫瘤患者在使用Atezolizumab治療時，OS有顯著增加，但使用Docetaxel化療時沒有顯著區別（圖5C）。與漿細胞特征相似，這些數據表明TLS和/或LAs的存在與Atezolizumab治療（而非Docetaxel化療）患者的OS獲益密切相關。含有TLS和/或LAs的腫瘤中三種瘤內B細胞亞群的基因高度富集，尤其是漿細胞基因，包括MZB1、TNFRSF17（BCMA）和免疫球蛋白（圖6A和6B）。對三種B細胞特征的定量分析證實了TLS和/或LAs的腫瘤中漿細胞的增加。并且，含有TLS和/或LAs的腫瘤中的生發中心B細胞和濾泡B細胞特征也增加（圖6C）。

四、總結

總的來說，該研究整合了Atezolizumab免疫檢查點抑制劑治療與Docetaxel化療兩個大型隨機臨床試驗的bulk RNA-seq隊列，以及scRNA-seq和蛋白質測量實驗，結果表明，NSCLC中高水平的瘤內漿細胞與接受Atezolizumab治療的患者更長的OS密切相關。隨著單細胞技術的興起，公開的單細胞數據也呈現爆炸式增長，這為科研人員的研究提供了堅實的基礎，公共大隊列數據，多組學整合以及新角度也可以發Cancer Cell！