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Title：結(jié)直腸癌和胰腺癌放療對免疫治療的影響
難治性結(jié)直腸癌和胰腺癌放射誘導(dǎo)的檢查點免疫治療反應(yīng)
大家好，今天給大家分享的是去年9月的一篇文章。免疫檢查點阻斷在微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)結(jié)直腸癌(CRC)和胰腺癌(PDAC)中的療效有限，這項研究主要描述了在MSS CRC和PDAC中聯(lián)合抗CTLA4和抗PD1抗體的放射治療2期試驗，該研究為放射和聯(lián)合免疫檢查點阻斷治療在其他免疫療法抗性癌癥中的概念提供了基本的證據(jù)。
方法部分
病人選擇
本研究共納入40例CRC患者和25例PDAC病患者(圖1)。所有患者都被確認為MSS，并且在入院時有轉(zhuǎn)移性疾病。
全外顯子組測序(WES)分析
WES共分析了來自每個方案隊列17名患者的41例具有配對胚系DNA的腫瘤樣本，在HiSeqX上使用雙末端讀長對樣品進行測序。研究者從雙末端wes讀長檢測獲得了SNV和indel突變，其read長度為150個堿基對，并根據(jù)GATK最優(yōu)流程對測序讀長進行了預(yù)處理。具體來說，首先使用bwa和samtools將測序讀長與人類參考基因組(GRCh37)進行比對，并使用picard的"MarkDuplicates"來標記重復(fù)。使用GenomeAnalysisTK工具進行indel重比對，使用BaseRecalibrator和dbSNP重新校準了堿基質(zhì)量。最后，基于預(yù)處理之后的序列數(shù)據(jù)，研究者使用MuTect和Strelka檢測SNV和indel。然后，使用bam-readcount軟件執(zhí)行每個SNV和indel的檢測以獲取正常/腫瘤讀長count值。除了可能的KRAS突變之外，其余突變也都使用了最小堿基質(zhì)量過濾閾值"-b 15"，這是為了捕捉所有可能的司機KRAS突變。檢測出來的所有突變使用snpEff進行注釋。研究者對所有突變，非同義SNV突變和錯義突變分別計算了腫瘤突變負荷(TMB)。變異等位基因頻率大于10%的編碼突變被視為"高質(zhì)量"的突變。
RNA-seq計算分析
在Illumina NextSeq 500平臺上進行雙末端測序，原始Illumina讀長經(jīng)過如下步驟質(zhì)控。首先，對讀長的末端進行修剪，去除質(zhì)量小于20的N和堿基。這之后，對剩余堿基的質(zhì)量分數(shù)進行排序，并計算第20百分位的質(zhì)量，如果第20百分位的質(zhì)量小于15，則整個讀長被丟棄。此外，修剪后少于40個堿基的讀長被舍棄。如果這一對中至少有一個讀長沒有通過質(zhì)控，其配對的讀長同時被丟棄。使用STAR將經(jīng)過質(zhì)控的讀長比對到人類基因組，隨后使用Rsubread軟件包的featureCounts工具將比對上的讀長映射給基因，這就產(chǎn)生了每個基因的原始read count值。使用R中的DESeq2包進行差異表達和統(tǒng)計分析，以未標準化的原始read count值作為輸入，使用FDR校正的p值<0.05來選擇差異表達基因，通過Kaplan-Meier方法來可視化OS和PFS曲線。
結(jié)果部分
免疫檢查點抑制和放射聯(lián)合治療的療效
在CRC隊列中，大多數(shù)患者(N=23，58%)在診斷時是轉(zhuǎn)移性的，從診斷到第1周期第1天的中位時間是44.9個月(表1)。在PDAC隊列中，大多數(shù)患者(N=18，72%)在診斷時為局部晚期或轉(zhuǎn)移性，從診斷到第1周期第1天的中位時間為16.9個月(表1)。
表1 基線患者和疾病的特征
在入組并開始治療的40名CRC患者中，疾病控制率(DCR)為25%，通過意向性治療(ITT)分析，客觀緩解率(ORR)為10%。CRC隊列的中位PFS為2.4個月，中位OS為7.1個月(圖3a,b)。同樣，根據(jù)ITT分析，25名PDAC患者的DCR為20%，ORR為12%。中位PFS為2.5個月，中位OS為4.2個月(圖3a,b)。共有34名患者接受了光子治療，12名患者接受了質(zhì)子治療。在這兩個隊列中，32%的患者(CRC13/40；PDAC8/25)因自身免疫毒性導(dǎo)致臨床衰退(N=4)、臨床進展(N=7)而在放射治療前停藥(表2)。
表2 最佳總體反應(yīng)的療效
在CRC隊列中，83%的患者出現(xiàn)了≥3級的不良事件(AE)，60%為3級，20%為4級，3%為5級。最常見的≥3級AE是淋巴細胞減少癥、脂肪酶或淀粉酶升高、貧血、腹瀉、結(jié)腸炎、低鈉血癥和疲勞，5級毒性是肺炎(表3)。在PDAC隊列中，60%的患者出現(xiàn)了AE≥3級，44%為3級，12%為4級，4%為5級。最常見的3級AE是淋巴細胞減少癥、疲勞、高血糖和肝功能測試升高，5級毒性是肝性腦病，可能與治療有關(guān)(表3)。
表3 與治療相關(guān)的不良事件
在對接受放療的患者進行的實驗方案分析中顯示，CRC隊列的DCR為37%，ORR為15%；PDAC隊列的DCR為29%，ORR為18%。圖2顯示了CRC和PDAC的最優(yōu)客觀緩解，如瀑布圖所示。一個CRC和一個PDAC病例的完全緩解(CR)非常明顯。癌癥患者隊列的中位PFS為2.5個月，中位OS為10.9個月(圖3c，d)。10名疾病控制為最佳總療效的患者的中位PFS為5.2個月，而17名沒有疾病控制的患者的PFS為2.4個月。相比疾病未控制者的中位OS為7.7個月，疾病控制者的中位OS為20.9個月。在PDAC隊列中，中位PFS為2.7個月，中位OS為6.1個月。5名疾病控制為最佳總療效的患者的中位PFS為5.5個月，而12名疾病未控制患者的PFS為2.5個月。
腫瘤突變負荷及編碼基因突變分析
通過WES分析了來自每個實驗方案隊列17名患者的總共41例腫瘤樣本。所有患者的TMB都很低(圖4a)，無緩解的患者(疾病進展=PD)與緩解的患者(疾病穩(wěn)定=SD，部分反應(yīng)=PR，完全反應(yīng)=CR)相比沒有區(qū)別。此外，TMB在治療前、治療中和治療后都沒有變化(圖4a)。對非同義基因突變的分析確定了突變的常見基因，包括CRC和PDAC的KRAS和TP53突變，以及CRC的常見APC突變(圖4b)。此外，DNA損傷和修復(fù)通路基因也存在顯著突變。沒有特異的DNA損傷和修復(fù)通路基因突變在有反應(yīng)或疾病穩(wěn)定的患者中出現(xiàn)。值得注意的是，4號患者(CRC PR)和41號患者(PDAC CR)有6個DNA損傷和修復(fù)基因的突變，這表明這些基因在預(yù)測反應(yīng)方面有潛在的重要性。
與疾病控制相關(guān)的重復(fù)RNA表達和干擾素反應(yīng)基因
對13例接受放射治療患者的32份樣本進行了RNA測序分析。活檢分析顯示，與無緩解的患者相比，緩解的患者中有467個差異表達基因，其中315個上調(diào)，152個下調(diào)(圖5a)。緩解者中上調(diào)基因的基因集富集到HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE中。放療前和放療后樣本的配對分析顯示，所有患者中有372個基因上調(diào)，209個基因下調(diào)。有趣的是，最顯著富集的基因基還是HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE，這表明干擾素γ應(yīng)答基因在放療誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)生物活性中的重要性。放射誘導(dǎo)的顯著基因包括多種MHC I類、MHC II類和重要的炎性細胞因子，這表明放射腫瘤中抗原呈遞增強(圖5b)。使用免疫細胞轉(zhuǎn)錄特征對RNA-seq數(shù)據(jù)中的免疫亞群進行去卷積，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細胞占主導(dǎo)地位，而CD8 T細胞卻很少。放療前緩解者的樣本中樹突狀細胞(DC)的豐度高于無緩解者，并且放療后樹突狀細胞的總體豐度增加，這在無緩解者中更明顯。此外，與放射后相比，所有患者在治療前都觀察到NK和CD8細胞豐度的增加，且在緩解者和無緩解者中，放射前和放射后的初始和記憶CD4 T細胞的比例可能發(fā)生變化。考慮到緩解者先天免疫應(yīng)答較高的指征，研究者分析了RNA-seq的重復(fù)元件RNA表達水平，緩解者與無緩解者相比，147種重復(fù)RNA的水平異常地高，只有9個重復(fù)RNA的水平較低(圖5c)。對主要重復(fù)元件的分析發(fā)現(xiàn)，與進展者相比，疾病控制患者的HERV-K內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達明顯較高(圖5d)。總的來說，干擾素應(yīng)答失調(diào)相關(guān)重復(fù)元件的去抑制與接受放射聯(lián)合免疫檢查點阻斷患者的疾病控制和應(yīng)答相關(guān)。
參考文獻：Radiation Induced Checkpoint Immunotherapy Response in Refractory Colorectal and Pancreatic Adenocarcinoma
