掃碼聯系客服
膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，據美國腦腫瘤注冊中心統計，膠質瘤約占所有中樞神經系統惡性腫瘤的80%。這是一篇來自中南大學湘雅醫院研究人員今年8月發表在Computational and Structural Biotec（IF：7.272）上的一篇關于膠質瘤中巨噬細胞的分子特征的文章。
膠質瘤患者腫瘤免疫微環境中巨噬細胞的分子特征
研究背景
膠質瘤按照腫瘤細胞的形態學劃分可分為星形細胞瘤、神經節細胞瘤、少突膠質細胞瘤和室管膜瘤等。按腫瘤細胞在病理學上的惡性程度來區分的話，膠質瘤目前最常用的分級是WHO分級，從低到高分為1-4級，1級惡性程度最低，預后最好，4級惡性程度最高，預后最差。
巨噬細胞的活化在炎癥和疾病進展中起著至關重要的作用。根據其功能和活化作用對巨噬細胞進行分類的話，一般可以分為兩種亞型：經典活化的M1巨噬細胞和替代活化的M2巨噬細胞。M1巨噬細胞由脂多糖和干擾素γ等誘導，其抗原遞呈活性強，分泌促炎細胞因子多。M2巨噬細胞常被IL-4,IL-10,IL-13,CSF-1和TGF-β激活，與組織重塑、血管生成和過敏反應有關。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是腫瘤微環境（TME）的組成部分，占膠質瘤非癌細胞的50%，促進腫瘤進展和轉移。從嚴格意義上說，TAM并不被認為是巨噬細胞中的一個亞群，因為這些細胞不是在穩態條件下存在，而是在許多腫瘤中被觀察到的。此外，巨噬細胞可以穿過血腦屏障，可以用于抗癌藥物的載體。
數據隊列
TCGA隊列：672個LGG和GBM 的RNA-seq數據和對應的臨床信息
CGGA隊列：兩個RNA-seq隊列（CGGA325和CGGA693）和一個微陣列隊列（CGGAarray）
單細胞隊列：GSE138794
其他：15個確診為膠質瘤的患者樣本
研究流程圖
結果
1.將巨噬細胞密度確定為潛在的預后標志
研究人員首先想通過利用WGCNA分析來篩選與巨噬細胞相關的基因以確定膠質瘤中巨噬細胞的預后價值。他們提取了TCGA隊列中的表達量前5000個基因用于WGCNA分析，得到了七個模塊，從中提取出945個與巨噬細胞模塊相關的基因用于后續分析。利用聚類分析算法——PAM算法，可以將TCGA隊列中具有相應基因表達特征的膠質瘤患者分為兩類（圖1A）。同時，利用PCA可以將TCGA數據集區分開來（圖1B）。在圖1C中的生存分析可以發現cluster1比cluster2的生存明顯差。之后在CGGA隊列中分析表達譜，從這些基因中驗證鑒定出434個基因（圖1D）。然后選取最佳閾值（圖1E），篩選出13個基因可以很好的區分樣本（圖1F）。這些基因已被報道在腫瘤中起重要作用，如TIMP1和EMP3與腫瘤中的巨噬細胞招募有關。因此，推測這13個基因可以被作為巨噬細胞特征的可靠鑒別標記。
圖1. M2巨噬細胞相關簇的構建與驗證
2.基于巨噬細胞分類的集群的臨床特征和 TME 特征
研究人員接著研究了上述分類中的兩個集群的TME特征。在圖2A中展示了64種類型細胞在兩個集群的表達差異，可以發現成纖維細胞、巨噬細胞和單核細胞等在cluster1中明顯增多，其生存也更差。通過TCGA隊列分析發現cluster1中的ESTIMATEScores, ImuneScores 和 StromalScores都高于cluster2（圖2B）。同時還比較了兩個集群的與抗原遞呈、細胞表面受體等相關的一些免疫檢查點分子水平，發現大部分分子都是在cluster1中高表達（圖2C）。同時在TCGA隊列中發現cluster1的病理分級要高，IDH突變比例也明顯高于cluster2，由此說明cluster1惡性程度更高。
圖2.兩個集群的特征
3.巨噬細胞分組集群的基因組特征
圖3A和3B中展示了兩個集群的全基因組CNV圖譜，根據體細胞突變分析發現，EGFR (29%), TP53 (27%), PTEN (23%) 以及TTN (23%)的突變更多的富集在cluster1中；相比之下，cluster2中IDH1 (93%), TP53 (52%), ARTX (38%) and CIC (25%)的突變更多（圖3C）。
圖3.兩個集群的基因組特征
4.富含巨噬細胞的膠質瘤中的 DMP 與腫瘤進展相關
通過設置cutoff（Δbeta value >0.4 和p value <0.05），共鑒定出8359個DMP，其中8301個上調，58個下調。圖4A熱圖中展示了鑒定出的DMP在兩組中情況。Cluster1的基因組表現出整體低甲基化趨勢，84.2% 的 DMP 處于低甲基化狀態（圖4B），在基因組的分布中，DMP主要集中在IGRs和TSS區域。圖4C中是DMP在染色體上的分布情況。對DMP相關的基因進行GSEA分析發現，高甲基化基因對腫瘤相關的生物過程有更關鍵的作用，如 TGFβ、腫瘤壞死因子 α (TNFα) 和白細胞增生（IL-2）等（圖4D）。GO 富集（圖4E）分析還發現T 細胞活化、增殖和分化活動增加。同時還計算并比較了兩個集群中主要免疫細胞類型的富集分數，Cluster1中的單核細胞和中性粒細胞水平高于Cluster2，而Cluster2中的B細胞、NK細胞和CD4+ T細胞水平更高（圖4F）。
圖4.兩個集群的甲基化特征
5.MScore的構建及其功能注釋
彈性回歸和PCA分析用于構建風險評分，也就是MScore。評估了64種細胞類型的表達水平與 MScores 的相關性，與成纖維細胞、巨噬細胞和單核細胞水平呈正相關（圖5A）。生存分析發現high-MScores和low-MScores的生存具有顯著差異（圖5C）。與巨噬細胞的激活和遷移、樹突狀細胞分化和 T 細胞增殖負調控相關的通路在high-MScores分組的樣本中富集更多。同時，研究人員還在另外15個膠質瘤數據集中驗證發現MScores可以很好的區分患者的不同生存情況（圖6）。此外，還探究了其在其他癌癥中的作用，發現在嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤、腎嫌色細胞和葡萄膜黑色素瘤等是不利因素，對彌漫性大B 細胞淋巴瘤、前列腺腺癌和甲狀腺癌有促進作用（圖 5D），這也說明了腫瘤微環境的異質性。MScores的GO富集功能分析還表明，MScores 與巨噬細胞活化、成纖維細胞增殖、肥大細胞活化調節和調節性 T 細胞分化呈正相關，表明存在免疫抑制微環境（圖5E）。生存分析發現high-MScores組的患者生存情況更差（圖5F）。圖5G中的IHC染色結果表明high-MScores的樣品的CD163表達更高。
圖5. MScore特征
圖6.基于MScores分組的生存分析
6.基于MScores的預后模型的構建
在TCGA和CGGA膠質瘤隊列中MScores被確定為危險因素，然后結合患者年齡、腫瘤等級、IDH突變和染色體1p/19q編碼缺失等因素構建預后模型，并在CGGA隊列中的693個樣本中得到驗證。
7.基于巨噬細胞分組的患者對免疫療法的反應的預測
研究人員首先評估了MScores是否能預測免疫阻斷治療對膠質瘤患者的治療效果，發現并不能很好的區分不同的生存情況（圖7A）。然而，當根據免疫治療反應類型進一步對患者進行分組時，疾病進展組、疾病穩定組和部分反應組顯示出不同的MScore，部分反應和完全反應組呈現出較低的 MScore（圖7B）。與部分緩解組和完全緩解組相比，疾病進展組和疾病穩定組顯示出更高的MScore百分比（圖7C和7D）。同時還以二元模式對治療反應樣本進行分組，發現完全/部分反應組的高MScore百分比高于穩定/進展疾病組（圖7E）。同時高MScore組的PD-L1水平也比較高（圖7F）。最后MScore的預后價值也在GSE78220中進行了進一步的驗證（圖7G-I）。
圖7. MScore對免疫的預測價值
討論
本研究首次通過WGCNA分析巨噬細胞密度作為膠質瘤預后標志的可靠性，利用提取的基因對患者進行分組，并通過多種方法機器學習方法進行驗證。為了驗證巨噬細胞的預后價值，評估了基于巨噬細胞密度分組的膠質瘤患者的腫瘤基因組學、TME、代謝和缺氧途徑的綜合情況（圖7J）。總之，本研究分析確定了一個由 26 個巨噬細胞特異性基因組成的巨噬細胞基因特征，并確定了它們在膠質瘤中的預后價值。研究結果驗證了巨噬細胞，尤其是 M2 巨噬細胞在膠質瘤進展中的調節作用。
