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Cell重磅|全面多組學鑒定新型胰腺癌治療靶點及早期診斷標志物
哈嘍，大家好，不知大家的國慶小長假過得怎么樣呢？有沒有出去盡情high呢？話說回來，小編的假期可以說是過得相當有意義呢，小編啊可是一個勤奮刻苦努力上進的好孩紙，這不放假期間也不忘讀文獻，可謂是受益匪淺[驕傲臉]。獨樂樂不如眾樂樂，今天小編就把這篇發表在Cell雜志（IF：41.582）上的題為“Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma”的文章分享給大家。萬字長文，內容豐富，結構清晰，如果你時間緊張，可以跳過中間詳解，只看“摘要”和“討論”兩部分。如果你和小編一樣愛學習，愛思考，那就從頭慢慢欣賞學習吧~
摘要
胰腺導管腺癌(PDAC)是一種高度侵襲性的癌癥，患者生存率低。為了了解驅動PDAC腫瘤發生的潛在分子改變，作者對140例胰腺癌、67例正常癌旁組織和9例正常胰腺導管組織進行了全面的蛋白質基因組分析。采用蛋白質組學、磷蛋白質組學和糖蛋白組學分析來表征蛋白質及其修飾。此外，對同一組織進行全基因組測序、全外顯子組測序、甲基化、RNA測序(RNA-seq)和microRNA測序(miRNA-seq)，以進行綜合分析，確定基因組改變對蛋白質表達、信號通路、和轉錄后修飾。為了確保下游分析的可靠性，通過多種正交策略評估腫瘤細胞形態，并通過基于組織學審查的腫瘤細胞性的病理學估計進行驗證。這種全面綜合的PDAC蛋白基因組特征對鑒定新的潛在治療靶點及早期診斷標志物具有重大意義。
數據來源
作者收集了140例未經治療的胰腺癌（35例PDAC和5例胰腺腺鱗癌）、67例正常鄰近組織和9例正常胰腺導管組織進行了全面的多組學研究。進行全基因組測序、全外顯子組測序、甲基化、RNA測序（RNA-seq）和miRNA測序、蛋白質組學、磷蛋白質組學和糖蛋白質組學的測序和分析，共獲得了8組組學數據（圖1A）。
樣本是從全球多個地方前瞻性收集的，控制了缺血時間，可以確保高質量的蛋白PTM分析（圖1B）。因為這些是手術切除的癌癥，絕大多數患者處于I-III期，只有9名IV期患者，截至到本研究數據分析時，因42%的患者還活著（圖1B），導致很多樣本的腫瘤細胞并不多，為了解決這種低腫瘤純度問題，作者根據以下3個標準確定了105個具有足夠腫瘤純度的樣本。
(1).KRAS變異等位基因分數（VAF）不小于 0.075；
(2).顯著的突變負荷和拷貝數變異（CNVs）（圖1C和1D）。
(3).基于反卷積方法，使用組織學以及基于DNA甲基化和RNA的不同的分子數據模式估計腫瘤細胞占比（圖S1C)。
上述確定的105個“高腫瘤純度”的樣本納入本分析，此外低純度的樣本也被保留下來，用于探測腫瘤微環境和腫瘤亞型。
結果展示
1. PDAC隊列的蛋白質基因組景觀
蛋白質組學、磷酸蛋白質組學和糖蛋白質組學分析共鑒定和定量了11,662 個蛋白、51,469 個磷酸位點和34,024個糖肽。作者發現整個 TMT plex 的質量控制樣本的測量重現性很高，并且沒有觀察到 TMT plex 效應（圖S1A）。在這項研究中，RNA 和蛋白之間的相關性中位數為 0.35（圖S1B），表明RNA和蛋白豐度之間存在差異，這在其他癌癥類型中也觀察到。當分別對腫瘤和 NAT 進行相關性分析時圖S1B），觀察到 NAT組內的中值相關性相對于腫瘤組降低，這在其他腫瘤類型中也存在，這可能是由于細胞類型特異性的翻譯調控。
使用不同的分子數據模式估計腫瘤細胞占比，發現這些腫瘤細胞的估值與KRAS VAF估值顯著相關，特別是采用基于DNA甲基化反卷積獲得的腫瘤細胞的估值與KRAS VAF估值高度相關（圖S1C)。除了105個具有足夠腫瘤純度的樣本，其余35例腫瘤純度較低，但它們確實含有腫瘤細胞，其他顯著突變基因(SMG)突變，低KRAS VAF，以及病理學檢查（圖1C）都證實了這一點。磷酸化和糖基化水平表明，高純度腫瘤和NAT樣本是分離的，但低純度的樣本在空間上位于高純度腫瘤和NAT樣本之間，支持本研究中的純度分類（圖S1D）。
2. 基因組改變對轉錄組、蛋白組和磷酸化的影響
在105個具有高純度腫瘤細胞的組織樣本中，在已知的胰腺癌驅動基因KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4中檢測到體細胞基因組改變，其比率分別為97%、83%、48%和29%（圖2A）。其中CDKN2A和SMAD4的變異百分比，由于包含了CNV和融合因此比較高。除了KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4這四個主要的突變基因，作者還在至少5%的腫瘤中檢測到ARID1A、RNF43、GNAS、KMT2C、KMT2D、TGFBR2和RBM10的改變（圖2A）。
作者全面描述了基因改變對相應基因產物（RNA、蛋白和磷酸化）的順式（cis）和反式（trans）影響（圖2B-C）。結果發現，TP53突變在蛋白和磷酸酶水平上具有最大的反式效應，在RNA/蛋白水平和磷酸酶水平上影響的基因具有很大差異，猜測這可能是由于廣泛的翻譯后調控。
TP53的突變與參與DNA損傷修復通路的蛋白（如MSH6、TP53和TP53BP1）的磷酸化增加有關，這表明這些改變在維持基因組完整性和防止細胞凋亡方面起作用（圖2C）。在TP53突變異腫瘤中，作者還觀察到MKI67的磷酸化程度更高，MKI67是細胞增殖的標志，這意味著這些突變可能導致細胞生長速度增加。作者進一步分析了TP53錯義突變與截斷突變的效應差異。發現TP53錯義組與野生型組相比，TP53蛋白表達和TP53-S315磷酸位點表達的順式效應明顯更大，而截斷組與野生型組之間的TP53蛋白順式效應沒有明顯變化。有趣的是，作者發現錯義組和截斷組都有類似的反式效應，這與DNA損傷修復通路中蛋白的磷酸化水平較高有關（圖S2A）。
SMAD4突變與SERPINE1在RNA和蛋白水平上的下調有關，SERPINE1是已知的轉化生長因子β（TGFβ）通路的靶點，與MAPK3蛋白表達和下游的MAPK信號（E2F4磷酸化）的上調有關（圖2B）。
拷貝數變異(CNVs)包括染色體9p、11q、18q和22q臂的擴增、GATA6病灶擴增、以及CDKN2A缺失（圖2D-E）,導致基因、蛋白和磷蛋白顯著表達變化（圖S2B）。由于觀察到大量擴增，所以作者接下來著重于在擴增的病灶內識別新CNV驅動因素（圖2E-F）。在擴增峰內的543個基因中，有165個拷貝數與相應RNA顯著相關，其中的23個也與相應蛋白顯著相關（圖2F）。通過這種方法找到的蛋白體現了 CNV 事件潛在的新型順式效應，并與肌動蛋白絲和細胞骨架形成相關（圖2F-G），肌動蛋白纖維的重組被報道與腫瘤發生和轉移有關。
此外，大多數受CNVs反式調控的蛋白位于7、9、17和18號染色體內，而CNVs在磷酸化水平上的反式效應比較零散（圖S2C），SMAD4和CDKN2A的CNV缺失與SMAD4和CDNK2A mRNA水平較低有關，HDAC1在S406、S410和S421以及SMARCA4在S613的較高磷酸化與SMAD4缺失有關，而CDKN2A缺失與NPM1在S70和S214的較高磷酸化有關（圖2I）。
為了識別可能受腫瘤中DNA甲基化調節的蛋白質，作者將RNA、蛋白質和磷蛋白水平與啟動子DNA甲基化（圖S2D）相關聯。結果顯示，GSTM1甲基化導致相應的RNA和蛋白下調，這與GSTM1在多種癌癥中的報道一致。啟動子DNA甲基化的程度在NAT中比在腫瘤中低（圖S2E-F）。作者確定了86個表觀遺傳學沉默的基因，其中22個是癌癥基因組圖譜（TCGA）以前報道的。有兩個基因（ZNF544和THNSL2）在超過10%的腫瘤中存在表觀遺傳學沉默，與患者的生存有顯著關聯（圖S2G-I）。通過基于甲基化的亞型確定了兩個聚類（聚類M1和M2），其中聚類M2擁有更廣泛的DNA高甲基化。作者還發現這些腫瘤的細胞性和甲基化狀態之間的正相關，與TCGA報道一致。
3.鑒定早期PDAC特定分子特征，用于腫瘤診斷和預后
大約80%的PDAC腫瘤無法切除，因為患者是在晚期被診斷出來的。因此對于這些患者來說，如果找到早期檢測穩定性的生物標志物可能會提高生存率。相對于NATs而言，腫瘤中失調的蛋白、磷酸化位點和糖基化位點代表了早期檢測/預后的潛在標志物。
相對于NATs，2218個和2244個蛋白在PDACs中分別明顯下調和上調（圖3A）。在NATs中具有高豐度的蛋白與正常的胰腺功能有關，而在腫瘤中上調的許多蛋白則富含參與表皮和內胚層發育的蛋白。為了確定與PDACs相關的蛋白，作者重點關注222個相比于NATs，在腫瘤中豐度增加2倍的蛋白（圖3A）。調整基質和免疫含量后，仍然有27個蛋白在PDAC中仍顯著上調2倍。此外，我們還發現，PDACs和NATs之間的差異表達與PDACs和正常胰管之間的差異表達相似(圖S3A)，而且在27個蛋白中，有21個蛋白與正常胰管相比上調2倍(圖3B，S3B)。重要的是，這27個蛋白在早期腫瘤中同樣受到調節（圖3B）。其中12個是分泌蛋白，可作為血清或胰液的早期檢測標志物。據報道，在胰腺癌數據庫中有11個蛋白表達升高，其中6個蛋白（HK2、LOXL2、COL12A1、C19orf33、TSPAN1和MDK）以前只得到RNA或細胞系蛋白組證據的支持，LOXL2蛋白豐度與總生存期縮短有關（圖3C）。在圖3B中強調的21個腫瘤相關蛋白中，通過獨立采集（DIA）質譜分析確定了14個作為早期檢測或預后標記的潛在蛋白。
與NATs相比，4908個磷酸化位點和1727個N-鏈接糖基在PDACs中的豐度明顯增加。一般來說，PTMs的豐度差異與蛋白水平的豐度差異相似，而45個N-鏈接糖位點和645個磷酸化位點的豐度上調>2倍，但蛋白豐度沒有相應增加（圖3D）。例如，雖然RALGAPA2的蛋白豐度在PDACs中下降（圖S3C），但S486和S696的兩個磷酸位點增加>2倍，而其他三個磷酸位點下降或與NAT相似（圖S3D）。據報道，RALGAPA2與胰腺癌的KRAS信號傳導有關，作者認為在將來的研究中可能需要探索這些特定位點的功能。
除了蛋白豐度外，這些PTMs中有許多與患者的預后有關。總體而言，PTMs的預后價值與蛋白的預后價值相似（圖3E）。然而，APOD上的一個特定的N-鏈接糖基化與較好的總生存率有關，而總蛋白豐度則沒有（圖3F）。雖然APOD的表達減少與其他類型的癌癥預后較好有關，但對這個糖基化位點的作用及其對APOD功能的影響知之甚少。此外，參與上皮-間質轉化的PIGR上的兩個磷酸化位點與預后較好有關，而ERBB信號調控因子ERRFI1上的一個位點則與生存率較差有關（圖3E）。
4.靶向糖蛋白生物合成，用于早期發現和治療干預
大多數糖蛋白是膜結合蛋白或分泌蛋白，可作為免疫治療和疾病檢測的潛在對象。PDACs和NATs的糖蛋白質組學分析確定了75種N-連接糖蛋白在腫瘤中蛋白水平上調>2倍（圖4A，S4A-B）。其中，57個在胰腺癌數據庫中被報道過，18個是在本研究中新發現的。在75個腫瘤相關糖蛋白中，有48個通過DIA分析得到進一步驗證。此外，與NAT和正常胰管組織相比，CA19-9抗原有關的粘液型O-連結糖蛋白在腫瘤和早期腫瘤顯著上調（圖S4C）。
作者根據不同的KRAS熱點突變（G12D、G12V、G12R和Q61H）進一步區分了腫瘤與正常胰管組織的N-鏈接糖蛋白表達（圖4B）。有趣的是，CEACAM5和CEACAM6在攜帶KRAS G12D、G12V和Q61H突變的腫瘤樣本中明顯上調，而在G12R突變的腫瘤樣本中沒有發現這種現象（圖4B-D）。據報道，CEACAM6是PDAC患者預后不良的標志物，CEACAM6 過度表達與PDAC 中的低細胞毒性T細胞有關。此外，從早期腫瘤中N-連接糖蛋白表達中，發現了包括半胱氨酸結合蛋白3（LGALS3BP）的幾個早期檢測或治療的候選物（圖4B、S4E）。
N-連結糖蛋白的生物合成主要受兩個因素調控，即糖蛋白基質和糖化酶。雖然完整糖肽(IGPs)的變化模式主要與糖蛋白底物的蛋白質豐度呈正相關(圖4C)，但IGP與蛋白質特征并不總是一致的，正如研究中描述的IGP豐度異質性一樣，在病理組織類型中顯示出不同的糖分支模式?？偟膩碚f，在腫瘤中上調的N-連接糖蛋白主要是由帶有水楊酸和/或巖藻糖的復合糖修飾，而在腫瘤中下調的N-連接糖蛋白主要由高聚甘露糖修飾（圖4C）。這些數據表明，關注PDAC中上調的N-鏈接糖蛋白的水楊酸化和/或巖藻糖化的糖類，可能會增加癌癥的標記物的特異性。
接下來，作者根據糖基化生物合成酶的豐度水平，研究糖基化改變的內在機制（圖4D）。結果發現，水楊酸化和/或巖藻糖化的IGPs與糖化酶的表達相關（圖4D）。比較糖基化酶的表達，發現與NATs相比，腫瘤中的糖基化酶(ST6GAL1、ST3GAL1、FUT3、FUT11、B4GALT1、B4GALT4、B3GALT5和ST6GALNAC1)表達上調（圖4E）。其中一些糖基化酶的變化，如腫瘤中ST6GAL1、ST3GAL1和B4GALT1的升高，在轉錄組水平未觀察到（圖S4F），突出了蛋白質組學和糖蛋白質組學在該研究中的附加價值。ST6GAL1和ST3GAL1調控水楊酸化，而FUT3和FUT11則負責巖藻糖基化，這與研究中觀察到的PDAC上調蛋白主要由水楊酸化和/或巖藻糖基化糖修飾是一致的，抑制這些酶可能作為PDAC的潛在治療策略。
5.激酶和底物的共同調控揭示了潛在的治療靶標
由于具有KRAS驅動基因突變的腫瘤很難通過靶向治療進行治療，對于已知KRAS突變頻率較高的PDAC，能否實現有效的治療干預仍是未知的。在胰腺癌發生過程中，蛋白質磷酸化大量參與了各種信號通路。為了研究被激活的KRAS下游的信號轉導通路，以尋找替代的治療靶點，作者分析了激酶各自磷酸化底物上的蛋白磷酸化事件。
通過分析41個腫瘤/NAT配對組織之間磷酸化肽的差異豐度，作者對5種磷酸化底物（MCM2, FLNA, BAD, MAPK6和STAT3）進行了分層，這些底物對應于5種激酶（CDK7, AKT1, PAK1, PAK2和SRC），這些激酶的抑制劑要么已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準，要么正在研究中（圖5A）。
有研究表明，磷酸化底物的升高與S期進入/進展（CDK7-MCM2）有關，抑制CDK7可導致細胞周期阻滯，抑制腫瘤進展。AKT1是KRAS的下游激酶（圖5B），AKT1幾乎在所有腫瘤中的表達上調都是KRAS突變的結果，而KRAS突變反過來刺激G1/S進程，進而刺激增殖活性。
一種Ⅰ類p21激活激酶，PAK1在超過70%的腫瘤中表達上調，PAK1對其底物磷酸化蛋白（BAD）S134位點的磷酸化可抑制BAD誘導的細胞凋亡，從而促進細胞增殖和存活。PAK1可以通過與RAC1直接相互作用而被激活，并且RAC1在大多數腫瘤中上調（圖5B-C）。PAK1是多種受體酪氨酸激酶的重要效應物，如MET。作者發現MET和PAK1在腫瘤中同時上調，MET與KRAS、RAC1、PAK1和PAK2在腫瘤的轉錄和蛋白水平上也一致上調（圖5C）。有研究報道，MET/PAK1信號軸通過調節細胞增殖、運動和細胞骨骼重塑來驅動胰腺致癌。
I類PAKs的另一個成員PAK2在近90%的腫瘤上調，并可能負責MAPK6-S189（圖5A-5C）的磷酸升高。磷酸化過程對MAPK6信號通路中MAPK6-PRAK復合物的形成至關重要，表明PAK2活性在調節與細胞運動相關的非典型MAPK信號通路中發揮重要作用。
擴大磷蛋白組學分析范圍，包括正常胰管組織，結果表明在PDAC腫瘤中，I類PAKs和其他激酶及其底物的表達譜與NATs和/或正常胰管組織有本質上的不同，表明這些蛋白是PDAC相關的激酶（圖5D、S5A-B）。
此外，通過評估不同KRAS熱點突變的腫瘤中相對于NATs的磷酸位點表達變化（圖S5C），作者進一步分層了19個激酶（圖5E），包括7個FDA批準的藥物靶點。這些不同的激酶表達模式提示了與特定KRAS突變相關的替代治療靶點。鑒于I類PAKs對PDAC的重要性，聯合抑制PAK1/2和KRAS下游通路，如MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR，可能會通過最大限度地抑制腫瘤細胞的增殖、運動和對細胞骨架的信號傳導來增加治療效果。
6. 與內皮細胞重塑、糖酵解和細胞連接失調有關的免疫冷PDACs
腫瘤和正常組織的分子分析的一個局限性是，它們不能完全剖析腫瘤內在生物學和微環境動力學之間的相互作用。這種認知差距對PDAC尤其重要，因為PDAC主要由腫瘤微環境特征驅動。本研究中，作者根據微環境細胞特征（主要是免疫浸潤程度）來對腫瘤進行分類。使用基于轉錄組學的反卷積方法來劃分本研究中所有140個腫瘤樣本的細胞組成(包括低純度腫瘤)。基于DNA甲基化的反卷積進一步證實了這一點（圖6A、S6A-C）。根據腫瘤/基質/免疫細胞組成，樣本被分為四個群組（圖6A）。
作者認為，特別值得關注的是D群腫瘤，其CD8+T細胞浸潤程度較高，并伴隨著細胞毒酶和免疫檢查點分子的表達增加。作者將這一集群的樣本注釋為"免疫熱"腫瘤，這些病例的組織學檢查證實了與腫瘤成分相關的顯著炎癥浸潤(圖S6D)。然而，在一個病例（C3N-00303）中，免疫標記很可能是收集的組織中包含了淋巴結的結果，突出了織學檢查在任何癌癥類型的研究中的重要性(圖S6E)。而集群A、B和C中的樣本幾乎沒有顯示免疫浸潤。由于集群A富含非腫瘤性的腺泡和胰島細胞，作者認為只有集群B和C是真正的"免疫冷"腫瘤組（圖S6F）。
值得注意的是，內皮細胞也富含免疫熱腫瘤（圖6B）。此外，細胞類型關聯網絡分析證實內皮細胞和細胞毒性免疫細胞之間存在很強的相關性（圖S6G）。據報道，內皮細胞代表循環系統和腫瘤細胞之間的物理連接，內皮細胞粘附蛋白對免疫細胞募集至關重要，并且在腫瘤相關血管系統中經常下調，在此研究中免疫冷腫瘤內皮粘附蛋白表達降低（圖6C）。同時，這些腫瘤也表現出VEGF和缺氧通路活性升高，這可以通過VEGF及其受體的表達以及推斷的通路活性來說明（圖6D）。VEGF和缺氧通路都是腫瘤發生過程中內皮細胞重塑的重要途徑。綜上所述，這些結果支持了免疫冷態PDACs中內皮細胞重塑和抑制免疫浸潤的關聯。
為了進一步分析免疫冷表型背后的機制，作者使用RNA、蛋白和磷酸化數據進行了通路分析。結果發現，免疫冷樣本的糖酵解水平較高（圖6E、S6H），包括負責生成和分泌乳酸的酶的富集，據報道乳酸是腫瘤微環境中已知的免疫抑制劑。此外，磷酸化特異性通路富集分析顯示，免疫冷樣本的細胞連接蛋白的磷酸化水平較高（圖S6I）而在轉錄組或蛋白組水平上沒有發現這種特征（圖6F）。
細胞連接蛋白在調控內皮細胞對小分子的通透性和免疫細胞浸潤方面發揮著重要作用。研究表明，細胞連接成分中的蛋白磷酸化失調可能代表了PDAC腫瘤中免疫排斥的一種機制。
這些數據共同表明，內皮細胞重塑，伴隨著血管內皮生長因子和缺氧通路的升高，糖酵解增加，以及細胞連接失調，可能共同抑制了免疫細胞的浸潤和功能（圖6G）。抑制這些生物過程，尤其是糖酵解和內皮細胞重塑（這兩者是多種癌癥類型的積極靶點），可用于提高免疫冷型PDACs的抗腫瘤免疫功能。雖然CD8+T細胞浸潤是一個有利的預后標志，但血管內皮生長因子和缺氧通路信號的升高都與生存率下降有關（圖6H-I）。
7. 具有強烈預后功能的蛋白基因組亞型
作者將三種主要的基于轉錄組學的PDAC亞型策略應用于整個腫瘤組，以探索樣本間異質性(圖S7A)。與先前報道一致，一些分子分類明顯重疊，如ADEX (Bailey)和外分泌樣(Collisson)，經典(Collisson)和胰腺祖細胞(Bailey)，以及鱗狀(Bailey)，準間質(Collisson)和基底樣(Moffitt)。值得注意的是，本研究隊列中的5個腺鱗癌樣本被分為鱗狀(Bailey)、準間質(Collisson)或基底樣(Moffit)組，這與對組織學上胰腺癌亞型的理解一致。基于非負矩陣分解(NMF)的蛋白質基因組學分型，使用來自所有140個腫瘤的多組數據，發現4個與RNA亞型顯著重疊的集群（圖S7B-C）。整個隊列的基于RNA和基于多組學的分型結果都嚴重受到腫瘤純度和細胞類型組成的干擾(圖S7B-G)。
為了減輕腫瘤純度對亞型劃分的影響，作者基于NMF的蛋白基因組學亞型限制在具有足夠具有高腫瘤細胞占比的的105個PDAC腫瘤上。這一分析揭示了兩個集群（C1和C2；圖7A）分別與Moffitt經典亞型和Moffitt基底樣RNA亞型有顯著重疊。由于Moffitt亞型是通過使用腫瘤內在基因簽名獲得的，兩種蛋白質基因組亞型之間的差異更有可能反映腫瘤內在生物信號，C2亞型與多種增殖信號通路活性升高和生存率降低相關(圖7B-C)。
盡管來自多組學數據的蛋白質基因組亞型與僅來自RNA-seq數據的Moffitt亞型之間總體上一致，但22個腫瘤的分類是不一致的（圖7A-C）。11例Moffitt基底樣腫瘤被歸類為蛋白質基因組經典型，11例Moffitt經典腫瘤被歸類為蛋白質基因組基底樣型。有趣的是，根據蛋白質基因組群分離Moffitt經典腫瘤或基底腫瘤顯示了不同預后結果的趨勢（圖7D-E）。作者發現，在97個既有蛋白質基因組學又有Moffitt分型的PDAC樣本中，蛋白質基因組學-二分類亞型比Moffitt-二分類亞型顯示出更強的預后分離（圖7F-G）。作者進一步分析了具有顯著的預后價值的392個蛋白和258個磷酸化蛋白，發現蛋白質基因組學-二分類亞型（69%的蛋白質和78%的磷酸化蛋白）比Moffitt-二分類亞型（39%的蛋白質和38%的磷酸化蛋白）具有更顯著的差異。
為了對這兩個亞型進行深入分析，作者將分子特征、激酶的磷酸化模式、糖基化酶和綜合蛋白基因組學提示的標志物，與C1和C2亞型相關聯。C2亞型與圖5強調的大多數激酶的高表達有關?；蚪M富集分析顯示，化療藥物與C1（如多西他賽、乙烯利和卡巴他賽）和激酶抑制劑與C2（如PP-242、CP466722和舒尼替尼）有關聯，C1或C2亞型中預測的相應藥物靶點的表達升高進一步證實了這一點。例如，mTOR、AKT和ERK激酶表達的升高以及PP-242簽名在C2中的富集表明，mTOR可能是這些患者的潛在治療目標。
本研究的二分類蛋白質基因組學分型只集中在105個具有足夠腫瘤純度的樣本，以便更好地理解腫瘤內在生物學。另一方面，免疫/微環境特征使用了所有140個樣品，因為免疫熱樣品通常具有較低的腫瘤純度（圖S7I）。當140個樣本進行蛋白質基因組分型時，觀察到4個亞型（圖S7B）。有趣的是，9個免疫熱樣本中的8個組成了C4亞型的子集（圖S7I），這與Moffitt經典亞型顯著重疊（圖S7B-C）。通過進一步將微環境/免疫分析結果與胰腺癌相似方面的研究進行比較，作者發現免疫熱樣本的微環境特征更有利于免疫細胞浸潤（圖S6D）。
總之，這些結果支持整合蛋白基因組分型與患者預后的關聯。在預后不良的蛋白質基因組基底樣亞型中（圖7B），對過度激活的增殖和信號通路進行進一步實驗研究可能有助于開發亞型特異性治療策略。
討論
本文中，作者描述了PDAC的全面蛋白質基因組研究，整合了多基因組特征，從而有助于深入了解基因組和表觀基因組擾動對基因和蛋白質表達以及PTMs的影響。
為了確保PDACs與成對匹配的NATs和正常的導管組織比較結果的可靠性，作者利用分子學、組織學和計算機算法，來注釋隊列中腫瘤的腫瘤細胞占比和正常組織的高細胞含量，其主要目的是使分析中只包括高質量的樣本（圖1和2），這種方法有力地識別了早期檢測、診斷或治療干預的潛在靶標（圖3、4、5、6和7）。作者驗證了KRAS是PDAC的主要驅動基因（圖1和2），與先前報道一致。然而針對KRAS蛋白本身的治療已經失敗，因為它的表面拓撲結構光滑，缺乏安全藥物結合的疏水口袋，導致除了化合物MRTX849之外，獲批的KRAS特異性藥物很少，而且只有不到1%的PDAC患者身上攜帶了KRAS G12C突變。
比較具有不同熱點KRAS突變的腫瘤的糖蛋白表達，發現攜帶G12D、G12V和Q61H突變的PDAC樣本中，CEACAM5和CEACAM6顯著上調，但是攜帶G12R突變的樣本無此變化（圖4B）。CEACAM5和CEACAM6屬于免疫球蛋白超家族；通過與其他同源或異源蛋白結合，介導細胞遷移、細胞侵襲和細胞粘附；并保護腫瘤細胞不發生失巢凋亡；雖然抗CEACAM5/6單克隆抗體（mAbs）對正常組織的影響仍有待確定，但mAbs MN-15和MN-3可以通過減少腫瘤細胞對內皮細胞和細胞外基質的粘附而阻礙轉移。 因此，抗CEACAM5/6藥物與一線化療相結合，可能會使攜帶KRAS G12D、G12V和/或Q61H突變的PDACs患者受益；另外，抑制KRAS持續激活導致的關鍵下游目標和節點是 PDAC 治療的一個有吸引力的策略。
MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是PDAC治療干預的主要目標，每條通路的多種抑制劑都可以在臨床上使用。作者對蛋白質組學和磷蛋白質組學檢測發現，本研究大多數PDAC中，PAK1/PAK2激酶被上調（圖5），這些激酶已被報道為介導細胞骨架運動、增殖和生存的重要信號通路的關鍵效應因子/調控因子。PAK1/PAK2位于腫瘤基因KRAS的下游，其抑制劑有可能成為靶向KRAS的新途徑，并可能與靶向典型KRAS下游MAPK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/mTOR通路的抑制劑結合。
PDAC的特點是高度抑制性的腫瘤微環境，對于大多數患者來說，細胞毒性T細胞的腫瘤內浸潤很低。盡管針對細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（CTLA-4）和程序性細胞死亡蛋白-1（PD-1）的免疫療法使幾種實體惡性腫瘤患者明顯受益，但除了占PDACs<2%的微衛星穩定性高的腫瘤，它們對PDACs患者無效。人們對PDAC中免疫激活的決定因素知之甚少，幾乎沒有提供治療指導。為了剖析腫瘤微環境，作者利用多組學數據，發現與VEGF和缺氧通路活動上調相關的內皮細胞的缺失，反過來又與免疫冷腫瘤中的免疫細胞排斥有關（圖6）。通過血管生成療法（如索拉非尼和NGR-TNF）將腫瘤內皮細胞重塑成正常的內皮細胞表型，可以實現白細胞內皮細胞粘附分子上調，并可能促進腫瘤內免疫細胞滲透。低氧誘導因子-1（HIF-1）是胰腺腫瘤中低氧微環境的主要效應器，并誘導細胞代謝進入糖酵解模式。因此，針對HIF-1活性靶向的方法，如防止HIF1-α和HIF1-β亞基相互作用的小分子，也可能對胰腺免疫冷腫瘤有益。
N-連接糖基化發生在內質網和高爾基體，由一系列糖苷酶和糖基轉移酶的活性介導。在各種實體惡性腫瘤(包括PDAC)中，已經發現了水楊酸糖蛋白的異常表達，并與侵襲性和轉移潛力有關。本研究發現，PDAC中大多數上調的N-鏈接糖蛋白是由水楊酸糖修飾的，與PDAC中ST6GAL1和ST3GAL1相對于NAT的上調一致（圖4）。這些腫瘤上調的N-鏈接糖蛋白與參與PDAC進展和轉移的重要信號通路有關（圖S4B）。因此，用更具選擇性的抑制劑來抑制這些水楊酸轉移酶，可能會通過廢除這些N-鏈接糖蛋白的功能來減弱PDAC細胞的生長、存活和轉移。
該研究表明，通過在多個組學水平上描述疾病狀態，可獲得獨特和有用的見解，從而使人們能夠更深入地理解與PDAC相關的基因組畸變的功能后果。整合轉錄組、蛋白組、磷蛋白組和糖蛋白組的檢測，以及PDACs、NATs和正常導管的比較分析，能夠檢測出與早期PDAC相關的蛋白形態，并確定可能在臨床上找到的潛在治療靶點?？傊?，本研究描繪了驅動PDAC表型的分子特征，并為未來的研究提供了豐富的生物信息源。
亮點
-蛋白基因組學特征揭示了基因組改變的功能影響
-磷蛋白質組學揭示了KRAS下游的潛在的治療靶標
-多組學將內皮細胞重塑和糖酵解與免疫排斥聯系起來
-蛋白質組學和糖蛋白質組學找到用于早期檢測或干預的候選標志物
局限性
本研究的目的是利用多組學技術全面描述PDAC腫瘤和NATs，并提供蛋白質基因組特征，解讀基因組改變對基因表達、蛋白質豐度和PTMs的影響。因為臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟(CPTAC)項目收集的組織是未經治療和手術切除的。所以，本研究在數據選擇上存在固有的局限性。
第一，雖然作者尋找了患者輔助治療的數據，但目前的隊列是未接受治療的樣本，這限制了對采用全身治療的轉移性疾病的外推，并且目前臨床試驗產生的轉錄組數據是有限的。
第二，蛋白質基因組數據為關聯不同的分子改變提供了豐富的資源，這對于生成假說、破譯分子功能或預測治療方案至關重要。然而，該相關性的因果效應無法從本研究中確定。生物學假設或治療預測需要使用細胞系，患者來源的異種移植(PDX)模型，或臨床試驗進行進一步的驗證。
第三，本研究的蛋白質基因組測量使用了大塊腫瘤和NAT組織，在這些組織中，無法充分考慮異質性對細胞和腫瘤微環境的影響。本研究中，作者選擇那些具有足夠腫瘤細胞的組織樣本進行分析來解決這一限制。然而，如果能夠采用激光捕獲顯微解剖測序(LCM-seq)或單細胞測序對組織進行表征，結果將更加精確。
