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近年來miRNA研究慢慢陷入低谷期，進入深水區，如果沒有特別亮眼的研究，很難沖刺高分。今天就跟著小編一起來看看一篇 2022年2月發表在Molecular Cancer（IF：27.401）上的文章如何“炒冷飯”，將自測數據結合 miRNA signature沖上 27+的，讓我們一起解開miRNA研究新套路。
一、研究背景
食管鱗狀細胞癌（ESCC）的預后效果較差，原因在于食道中存在廣泛的淋巴網絡，再加上缺乏保護性血清，導致侵襲性早期區域腫瘤進展和轉移，并且在早期階段，ESCC患者通常無癥狀，導致診斷延遲。目前尚無臨床相關的無創生物標志物可用于食管鱗狀細胞癌早期發現。
miRNA已被公認為有前途的非侵入性生物標志物候選，這主要是由于它們的結構穩定性和循環中的豐度。然而，盡管已經提出幾種單獨的循環miRNA用于ESCC診斷，但它們的臨床翻譯潛力仍然值得懷疑。
故本研究旨在使用系統的全轉錄組miRNA表達譜分析，建立并評估了一種基于循環miRNA的標記，用于早期檢測ESCC。
作者的研究設計包括五個主要階段：計算機發現階段，組織驗證階段，回顧性血清生物標志物優先排序階段，回顧性血清訓練和驗證階段，以及前瞻性血清訓練和驗證階段，通過使用 7 個獨立、回顧性和前瞻性、跨國、多中心隊列整合轉錄組范圍的生物標志物發現和臨床驗證，建立了一種新穎的、非侵入性的、基于 miRNA 的特征。
二、結果
1、鑒定可將 ESCC 與正常粘膜區分開來的 18-miRNA
在計算及發現階段，作者使用三個基于組織的全轉錄組miRNA表達數據集（TCGA ESCC，GSE55856和GSE43732）來發現強大的miRNA候選物。作者評估miRNA是潛在的候選者的標準如下：
（1）在ESCC和正常組織之間差異表達（標準：log2 FC >0.5，FDR調整后的p<0.05）;
（2）區分ESCC和正常標本（標準：AUC>0.7）;
（3）在ESCC中上調，具有相對較高的表達，以利于血清樣品中的檢測（標準：平均表達>所有差異表達的miRNA的中位平均表達）。
由此從每個數據集中鑒定出癌癥組織中明顯過表達的miRNA（圖1A-C），并通過overlap分析選出18個候選miRNA（圖1D）。
主成分分析表明，這些miRNA導致ESCC患者和健康個體之間形成不同的簇，這表明這些miRNA可用于區分ESCC患者。
為了評估 18-miRNA 的診斷潛力，作者采用了雙管齊下的策略。 首先，在每個數據集中，使用 2 倍交叉驗證（重復 100 次）進行多元logistics回歸，以證明特征的診斷性能（平均 AUC = 0.98、0.99、0.98；圖 2）。
其次，在 GSE55856 數據集上訓練了一個多元logistics回歸模型，然后將相同的統計模型應用于所有三個數據集，以進一步驗證和確認 18-miRNA 特征的診斷性能（AUC = 0.99、1.00、0.99）。
接下來，為了確定這些候選miRNA的功能意義，作者基于從 miRTarBase 數據庫 (V8) 獲得的經過實驗驗證的 miRNA-靶標相互作用構建了 miRNA-mRNA 調控網絡。總的來說，作者根據以下標準在TCGA數據集中鑒定出393個在腫瘤和正常樣品之間差異表達的基因：|log2 FC| > 2和BH-adjust p < 0.01。
2、ESCC患者回顧性隊列血清中8-miRNA循環特征的訓練和驗證
由于作者要開發一種非侵入性液體活檢方法，故接下來作者檢查了基于組織的18-miRNA組合在基于血清的生物標志物優先排序隊列中的轉化潛力的診斷性能。在18個miRNA中，與健康對照組相比，ESCC患者的血清中有8個miRNA（miR-103，miR-106b，miR-151，miR-17，miR-181a，miR-21，miR-25和miR-93）在ESCC患者的血清中顯著上調（p <0.05，student t-tests）。
由此將研究重點放在8個上調的miRNA候選物。作者首先采用logistics回歸推導出風險評分公式，再使用該風險公式和來自血清訓練隊列的Youden指數（0.582）作為臨界閾值，以區分高危和低危人群，通過AUC和相應的95%置信區間，敏感性和特異性評估了該8-miRNA在訓練隊列中的診斷性能（圖3A）（AUC為0.83（95%CI，0.79-0.87），靈敏度為78%，特異性為75%）。緊接著在另外兩個獨立的患者隊列評估其性能，與血清訓練隊列一致，循環 miRNA signature在兩個血清驗證隊列中都取得了穩健的表現（圖3B-C）。
接下來，作者使用血清驗證隊列2，比較了8-miRNA signature與經典的腫瘤標記物——鱗狀細胞癌相關抗原(SCC-Ag)在ESCC患者中的診斷性能。結果表明，8-miRNA在區分所有疾病階段的ESCC患者方面顯著優于SCC-Ag（圖3D）。
上述結果已經證實了8-miRNA對ESCC早期診斷測定的潛力，但其是否對ESCC而不是其他癌癥類型具有診斷特異性尚未明確。
因此作者進一步使用公共血清miRNA數據集評估了8-miRNA在其他主要惡性腫瘤（包括結直腸癌，前列腺癌，肺癌和乳腺癌）中的診斷性能。
將8-miRNA的評分公式應用于這些數據集，并評估了每種癌癥類型中區分癌癥患者和健康對照組的診斷性能。與ESCC相比，其他癌癥類型中8-miRNA的AUC值顯著降低。
總的來說，這些數據支持 8-miRNA 特征的診斷功效，以及它在檢測早期 ESCC 方面的潛力。
3、在兩個獨立的前瞻性 ESCC 患者隊列中驗證循環 miRNA 特征的診斷性能
為了驗證其臨床效果，故作者在兩個隨機的前瞻性ESCC患者隊列中檢查了其性能。
作者使用qRT-PCR測定，以評估兩個血清標本（分為訓練集和驗證集）中8-miRNA特征的表達，構建logistics回歸分析，結果表明，8-miRNA特征在區分ESCC患者和健康對照的能力方面顯著優于單個miRNA（訓練集AUC=0.92，驗證集AUC=0.93）。
此外作者進行了單變量和多變量分析，以確認循環miRNA特征是檢測所有階段的ESCC患者以及特異性I期患者的唯一重要預測因子。
最后驗證了8-miRNA的成本效益。由于I-IV期ESCC患者的診斷風險評分顯著升高（所有p<0.001，單側Student’s t-tests），作者檢查了8-miRNA用于識別高級別上皮內瘤變患者的診斷性能。
結果表明8-miRNA能夠識別患有高級別上皮內瘤變（n = 13，p<0.01，單側Student’s t-tests；圖 5）。然而，與健康對照組相比，低級別上皮內瘤變（n = 8）或食管炎（n = 6）患者的風險評分沒有顯著變化。因此循環miRNA特征可能用于早期檢測高風險的癌前病變。
三、討論
在三個基于組織的全轉錄組miRNA表達數據集中發現強大的miRNA候選物，再采用qRT-PCR評估了候選miRNA的表達水平，構建了miRNA-mRNA網絡，使用多變量logistics回歸評估其診斷性能，再輔以血清驗證隊列和臨床樣本驗證，評估其臨床效果及進行成本效益分析，采用全面的生物標志物發現過程，這思路也是絕了！
參考文獻
[1] Miyoshi, J., Zhu, Z., Luo, A. et al. A microRNA-based liquid biopsy signature for the early detection of esophageal squamous cell carcinoma: a retrospective, prospective and multicenter study. Mol Cancer 21, 44 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01507-x
