Nat Commun|多維度深刻理解食管癌致病機制-蛋白組和磷酸化修飾蛋白組定義食管癌靶向治療分子亞型

今天給大家帶來一篇汕頭大學醫學院潮汕沿海地區高發腫瘤分子生物學廣東省高校重點實驗室、基礎醫學研究所的李恩民教授/許麗艷研究員課題組與廈門大學藥學院、應激細胞生物學國家重點實驗室的劉文教授課題組的研究，通過對食管癌腫瘤和鄰近的非腫瘤組織進行了基于質譜的蛋白質組學和磷酸化修飾蛋白組學分析，揭示了食管癌中失調的蛋白質和磷酸化蛋白；并通過聚類研究找到了可以改善食管癌患者診斷并為預后提供潛在治療前景的分子分型。

基于大規模高分辨率質譜分析，從蛋白質組學定義明確食管癌靶向治療的分子亞型

摘要：

食管癌(EC)是侵襲性最強的癌癥類型之一，是中國癌癥相關死亡的第四大原因。盡管在過去的幾年里，治療有了很大的改善，食管癌的5年總生存率(OS)仍然在15 - 25%的范圍內;病人大多受益于早期診斷。在之前對食管癌基因的基因組研究中，將基因組改變與表型聯系起來，揭示了一些驅動基因，如TP53、RB1、ZNF750、NOTCH1、FAT1和NFE2L2，突變頻率很高。蛋白質是基因功能的執行者，基因組的改變將主要轉化為蛋白質水平的變化，蛋白質功能進一步通過翻譯后修飾(PTMs)進行調節。蛋白水平和翻譯后修飾(PTMs)都是細胞表型的主要決定因素。因此，蛋白質組學和磷蛋白質組學分析可能為基因組分析無法解釋的腫瘤生物學提供更多的見解。以質譜(MS)為基礎的大規模蛋白質組學已經為結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和肝癌患者確定了新的癌癥亞型和治療靶點，并提供了寶貴的資源，擴大了我們對這些癌癥的認識。研究人員對124對食管癌腫瘤和相應的鄰近非腫瘤組織進行了蛋白質組學分析。蛋白質組學分析揭示了食管癌中異常調節的蛋白質、磷酸鹽和通路的目錄。蛋白質組分型確定了與患者生存相關的兩種亞型。構建亞型診斷和預后模型以供臨床應用。此外，通過功能實驗預測并驗證了幾種潛在的針對惡性S2亞型的藥物，這可能為提高食管癌治療效果提供新的治療機會。

關鍵詞：

蛋白質磷酸化:蛋白質磷酸化是最重要、研究最廣泛的共價修飾之一，在各種生物學過程和通路中發揮著不可替代的作用，并可逆的決定了細胞的動力學和可塑性。上游激酶可識別并修飾特定的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，而修飾位點能夠被上游磷酸酶識別并去磷酸化，磷酸化位點也可以通過形成對接位點從而介導蛋白質-蛋白質相互作用。

質譜法(Mass Spectrometry,MS)：即用電場和磁場將運動的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片，有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離子、亞穩離子、負離子和離子－分子相互作用產生的離子）按它們的質荷比分離后進行檢測的方法。測出離子準確質量即可確定離子的化合物組成。這是由于核素的準確質量是一多位小數，決不會有兩個核素的質量是一樣的，而且決不會有一種核素的質量恰好是另一核素質量的整數倍。分析這些離子可獲得化合物的分子量、化學結構、裂解規律和由單分子分解形成的某些離子間存在的某種相互關系等信息。

結果：

對食管癌進行了大規模的蛋白質組學和磷酸化修飾蛋白質組學分析

124對食管癌腫瘤和鄰近正常樣本(隊列1)被分為25組進行串聯質譜標簽(TMT)蛋白組學，對31對樣本進行無標記磷蛋白組學。來自295名患者(隊列2)的食管癌腫瘤樣本用于免疫組化；蛋白組學結果顯示共鑒定出14252個蛋白，定量蛋白數為6468個，磷酸化蛋白組學俠士，磷酸化位點數為73651個，磷酸化蛋白有7943個，定量磷酸化蛋白位點數為67393個（圖a-d）。無監督聚類分析和分層聚類結果證明腫瘤樣本能與癌旁非腫瘤樣本顯著分開且無批次效應(圖e-f)對定量蛋白和定量磷酸化蛋白進行亞細胞定位發現，絕大部分蛋白定位于細胞核、細胞膜、細胞質基質、線粒體和胞外空間(圖g)。

差異蛋白的分析與通路富集

根據蛋白組學和磷酸化修飾蛋白組學的結果進行差異分析，其中圖a為差異蛋白的火山圖，顯著的磷酸化微店的統計數量如圖c所示，對顯著性差異蛋白的功能富集結果顯示，細胞周期、DNA修復、免疫反應和表皮間充質轉化(EMT)途徑等在腫瘤中上調的蛋白中占過高比例。然而，代謝和雌激素反應相關途徑在下調的蛋白中過多；磷酸化修飾蛋白組學的結果顯示雌激素反應相關蛋白的下調與之前的研究一致，表明雌激素信號與食管癌之間可能存在聯系。除了參與細胞周期、EMT和雌激素反應相關通路的蛋白外，磷蛋白組學數據還顯示，腫瘤中剪接體中的蛋白通常高度磷酸化。至此，作者將蛋白組學的結果與之前相關的基因組學研究結果相對比，發現35個已報道的顯著變化基因中的30個基因可以在蛋白組學中被檢測到，所以得出結論，有些疾病發生過程中的病變可能在只在蛋白組學層面被發現，這個結論揭示了食管癌發病機制可以從多個角度進行研究。

通過蛋白組學分析將食管癌分為高危組和低危組（S1亞型、S2亞型）

補充圖

研究人員將蛋白組學差異分析結果排名在前25%的蛋白進行無監督聚類分析和分層聚類分析，并確定了兩個平均剪影寬度最大的主要亞型，S1和S2亞型分別包含61和63個腫瘤樣本(補充數據4a和圖a-b)，與S1亞型患者相比，S2亞型患者的總體生存期(OS)和無病生存(DFS)預后更差，其中S1和S2亞型的OS中位數分別為1841天和655天(log-rank P<=0.05)， S1和S2亞型的DFS中位數分別為1244天和510天(log-rank P<=0.05)(圖c)。S1和S2亞型患者的臨床病理特征無顯著差異，S1和S2之間差異表達蛋白的熱圖分析顯示，S2亞型表現出極端表達模式;上調蛋白的表達量非常高，下調蛋白的表達量非常低。事實上，在腫瘤和非腫瘤樣本中發現的差異表達蛋白和S2和S1亞型中發現的差異表達蛋白之間存在顯著的重疊(圖d)。與S1亞型相比，S2亞型中有984個蛋白表達顯著上調，1012個蛋白表達顯著下調。其中230個蛋白的表達水平發生了1.5倍以上的變化，S2亞型中分別有137個和93個蛋白表達水平上調和下調(圖e)。 S2樣品中分別有1446和1415個位點顯著增加和減少(圖f)，這些顯著改變的磷酸鹽中絕大多數的fold change大于2。在后續對兩種亞型的富集分析結果中，S2中上調的蛋白在mRNA加工、DNA復制、DNA修復、E2F靶點和G2/M檢查點等通路中富集(圖d, g和補充圖4d和補充數據4f)，與非腫瘤樣品相比，在腫瘤樣品中上調的蛋白中也富集。這說明這些通路的活性從非腫瘤到S1亞型腫瘤再到S2亞型腫瘤逐漸增強，可能導致S2亞型的惡性表型。下調蛋白富集的肌發生相關通路也顯示出類似的趨勢(圖3d,h和補充圖4d)。值得注意的是，與非腫瘤樣本相比，腫瘤樣本的局灶黏附和emt相關通路富含上調的蛋白。磷酸化修飾蛋白組學中差異富集結果主要在剪切體和有絲分裂信號通路富集，與腫瘤組織富集的信號通路結果一致，意味著這些通路的磷酸化對于食管癌發生過程中有重要的作用(圖h)。

發現食管癌中由ELOA和SCAF4組成的亞型診斷特征

接下來研究人員為了進一步確定食管癌亞型的診斷模型，分別使用最大值進行特征設置為1、2、3或4的特征數量，以ROC曲線下面積AUC作為標準，共識別出11個獨特的模型（圖a），其中模型“ELOA, SCAF4”頻率最高，500個交叉驗證實驗證明了“ELOA, SCAF4”具有良好的預測性能(平均AUC = 0.970)(圖b)。為了進一步驗證模型的效果是否可靠，研究人員進行了免疫組化實驗驗證，結果顯示，“ELOA, SCAF4”在S2亞型中的免疫組化染色效果明顯高于S1亞型(圖e-f)，Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗顯示S2亞型的總體生存期(OS)和無病生存(DFS)都比S1亞型短，進一步說明了模型的準確性。

S2亞型治療藥物的預測和驗證

為了尋找食管癌患者的治療策略，研究人員選擇了在腫瘤和非腫瘤樣本之間差異表達的蛋白用于藥物預測，并與Connectivity Map數據庫中的結果進行比對，篩選到五種藥物。同時，對于更加惡行的S2亞型，研究人員將S1和S2亞型中都有差異變化并顯示不良預后的蛋白與Connectivity Map數據庫對比，從映射的藥物中選擇負連通性得分最高的6種候選藥物。后續實驗驗證過程中，發現這六種藥物都發揮了抑制腫瘤組織增殖的作用(圖d-h)。

藥物對兩種亞型中差異表達蛋白的調控作用機制

實驗過程中GW8510、Menadione和Sulconazole這三種藥物效果作用尤為有效，所以進一步研究三種藥物調控作用機制，在KYSE150細胞中，S1和S2亞型對這三種藥物反應的蛋白表達存在顯著差異，說明了這三種藥物對S1和S2亞型中差異表達的絕大多數蛋白質都表現出了顯著的影響。

文章小結：

到這里文章就結束啦，整體看文章主要創新點在于將腫瘤的分子分型通過磷酸化修飾蛋白組、蛋白質組等組學技術，對食管癌進行分子譜的系統描繪，并根據分子特征譜，進行腫瘤的精準亞型分類及針對亞型的精準治療。腫瘤分子分型目前作為國家精準醫療戰略的重點研究投入方向，目前也備受頂刊雜志青睞。