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單細(xì)胞技術(shù)評估胰腺導(dǎo)管腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險
小編今天給大家?guī)淼氖?022年11月發(fā)表在International Journal of Molecular Sciences（IF=6.2） 雜志上的一篇利用單細(xì)胞技術(shù)開發(fā)評估導(dǎo)管腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險的方法。(Estimating Metastatic Risk of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma at Single-Cell Resolution)。
摘要：
胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)具有瘤內(nèi)異質(zhì)性，患者往往在發(fā)生轉(zhuǎn)移后才被確診。因此，研究如何有效地評估胰腺導(dǎo)管腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險具有重要意義。本研究中，我們提出了scMetR方法來評估胰腺導(dǎo)管腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，該方法主要基于單細(xì)胞RNA測序進(jìn)行展開。首先，我們確定了多種細(xì)胞類型，包括腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞類型。然后，我們根據(jù)scMetR評分將腫瘤細(xì)胞分為三個亞群，包括轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)，移行性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞(TransMTC)和常規(guī)腫瘤細(xì)胞(ConvTC)，通過比較轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)和常規(guī)腫瘤細(xì)胞(ConvTC)，我們確定了轉(zhuǎn)移特征基因 (MSGs)。功能富集分析顯示，上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因 (MSGs)富集于多個轉(zhuǎn)移相關(guān)通路。我們還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因 (MSGs)的患者預(yù)后更差。轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)空間定位顯示，它們偏向定位于癌和導(dǎo)管上皮區(qū)域，同時這些區(qū)域富集了導(dǎo)管細(xì)胞相關(guān)的炎癥。我們進(jìn)一步分析了細(xì)胞間的相互作用，觀察到轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的ADGRE5信號通路之間的細(xì)胞作用比其他腫瘤亞群中增加。最后，我們預(yù)測了12種具有逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移特征基因 (MSGs)表達(dá)潛力的候選藥物。綜上所述，我們借助單細(xì)胞技術(shù)開發(fā)了scMetR方法，該方法可能有助于分析腫瘤的異質(zhì)性。
介紹
胰腺癌(PC)是最危險的癌癥之一，其5年生存率低于5%。大約90%的胰腺癌患者是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)。胰腺導(dǎo)管腺癌具有較高轉(zhuǎn)移擴散能力，這往往會導(dǎo)致不良預(yù)后。手術(shù)切除仍然是唯一可能治愈的治療方法。當(dāng)胰腺導(dǎo)管癌發(fā)生遠(yuǎn)端遷移的時候。
腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程，包括局部侵襲、體內(nèi)轉(zhuǎn)移、血液循環(huán)中存活、外滲、適應(yīng)新環(huán)境生存，最終在遠(yuǎn)處器官定植和生長。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞黏附分子的表達(dá)逐漸減少，并獲得間充質(zhì)表型以及遷移和侵襲能力，能夠使癌細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤并在其他地方形成轉(zhuǎn)移瘤。
在遠(yuǎn)端器官中具有明顯的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)過程。間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)可使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)上皮形態(tài)，有利于胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞侵襲周圍組織。因此，原發(fā)組織和遠(yuǎn)處器官中可能存在具有轉(zhuǎn)移特征的細(xì)胞。以往研究報道腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)的差異也與轉(zhuǎn)移相關(guān)。不成熟的腫瘤比分化程度更高的腫瘤更具侵襲性。低分化腫瘤的擴散速度比高分化腫瘤快。胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)具有不同的瘤內(nèi)異質(zhì)性，因此評估其轉(zhuǎn)移風(fēng)險具有一定的挑戰(zhàn)性。
單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)是可以區(qū)分腫瘤中不同的細(xì)胞類型。一些研究基于臨床、組織學(xué)和基因組特征來評估腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。然而，這些研究不能應(yīng)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)。
我們對之前使用原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們確定了胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中的主要細(xì)胞類型，并剖析了胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的異質(zhì)性，建立了用于評估腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移風(fēng)險的scMetR方法。研究過程中我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中異質(zhì)性的亞群具有不同轉(zhuǎn)移風(fēng)險。我們進(jìn)一步鑒定了轉(zhuǎn)移特征基因 (MSGs)，并對其從功能富集、患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的空間表達(dá)模式、腫瘤亞群的空間位置和細(xì)胞間通訊等多個角度進(jìn)行驗證，探討腫瘤亞群的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。上述發(fā)現(xiàn)在一個獨立的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中得到重現(xiàn)。最后，通過基于轉(zhuǎn)移特征基因 (MSGs)的藥物預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)了一些轉(zhuǎn)移的候選抑制劑。
圖1. 胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)數(shù)據(jù)分析流程。
結(jié)果
胰腺導(dǎo)管腺癌原發(fā)和轉(zhuǎn)移患者的主要細(xì)胞類型
我們使用10個原發(fā)胰腺導(dǎo)管腺癌患者和轉(zhuǎn)移胰腺導(dǎo)管腺癌患者的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。質(zhì)量控制之后，我們獲得了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，其中原發(fā)癌癥樣本一共有8201個細(xì)胞，轉(zhuǎn)移樣本一共有7332個細(xì)胞。我們對所有細(xì)胞的高變異基因(HVGs)進(jìn)行了主成分分析(PCA)。采用T-分布隨機鄰近嵌入(t-SNE)技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行可視化。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞主要根據(jù)樣本分組，這提示樣本之間的批次效應(yīng)存在于細(xì)胞中(圖2A)，并且會混淆PDAC的關(guān)鍵生物學(xué)變異。因此，我們整合所有的樣本并進(jìn)行批次矯正。然后，我們檢查了整合數(shù)據(jù)的樣本分布，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞的分布是無偏的(圖2A)。使用Seurat (V3.2.2)進(jìn)行的無監(jiān)督聚類顯示了7個簇，這些簇被注釋為腫瘤細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(圖2B)。為了確定每個細(xì)胞簇的身份，我們通過進(jìn)行差異基因表達(dá)分析產(chǎn)生了細(xì)胞簇特異性的標(biāo)記基因。我們使用了一些知名的標(biāo)記基因來鑒定細(xì)胞類型，如EPCAM和KRT19代表腫瘤細(xì)胞，COL1A1和ACTA2代表癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF), CD3D和CD3E代表T細(xì)胞，CD68和CD14代表巨噬細(xì)胞(圖2C,D)。當(dāng)這些標(biāo)記基因在對應(yīng)的細(xì)胞中高表達(dá)時，說明注釋的標(biāo)記基因是正確的。
為了進(jìn)一步驗證注釋基因的準(zhǔn)確度，我們使用inferCNV工具對注釋基因進(jìn)行基因拷貝數(shù)分析。使用Genome Sequence Archive的正常上皮細(xì)胞表達(dá)譜作為參考基因，分析結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞比正常上皮細(xì)胞具有較多的拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)(圖2E)。這與胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)具有大量拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNA)的結(jié)果一致。
圖2。胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的細(xì)胞組成(A)不同患者的t分布隨機鄰域嵌入(t-SNE)圖。細(xì)胞根據(jù)患者進(jìn)行著色,整合前(左)和整合后(右)。(B)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中4種主要細(xì)胞類型的t-SNE圖。(C)各細(xì)胞類型特異性標(biāo)記的熱圖。(D)小提琴表達(dá)圖。y軸表示表達(dá)水平。(E)推斷的正常上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)變異(CNV)熱圖。
2.2. 腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性
目前認(rèn)為，胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)可以由多種腫瘤細(xì)胞亞群組成，這些腫瘤細(xì)胞在許多特性(如轉(zhuǎn)移風(fēng)險)方面存在差異。為了探索腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，我們利用基于平均剪影寬度(silwidth)的分辨率將腫瘤細(xì)胞重新聚類成亞簇。silwidth代表一個簇的相似性和不同簇的差異性。silwidth值越大，說明同一簇的細(xì)胞具有較高的相似性。silwidth值越大，說明同一簇的細(xì)胞具有較高的相似性。我們通過0.1的步驟計算了0.1到1不同分辨率下的平均silwidth寬度，觀察到silwidth寬度的平均值在0.1時最大(圖3A)。最后，在0.1的分辨率下將腫瘤細(xì)胞劃分為6個亞簇(圖3B)。為了估計每個亞簇的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，我們使用SEMT和SCyTo方法進(jìn)行評估，其中SEMT是評估間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)相關(guān)基因表達(dá)的評分，SCyTo是評估腫瘤細(xì)胞差異潛能的評分。之前的一項研究發(fā)現(xiàn)，分化良好的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞更相似，與分化較差或未分化的腫瘤細(xì)胞相比，傾向于生長和擴散更慢。此外，間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)也與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了準(zhǔn)確評估腫瘤細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，我們通過整合SEMT和SCyTo，提出了轉(zhuǎn)移風(fēng)險評分scMetR(圖3C)。結(jié)果顯示，亞群0、1和2的scMetR評分有顯著差異(Wilcoxon檢驗:p < 0.01;圖3D)。因此，我們確定了三個具有不同轉(zhuǎn)移風(fēng)險的亞群。我們將亞群0和2定義為具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)，亞群3、4和5定義為轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(TransMTC)，亞群4和5定義為轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(TransMTC)。亞簇1作為傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞(ConvTC)。我們比較了不同腫瘤亞群的scMetR評分，發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)的scMetR評分顯著高于移行轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(TransMTC), 移行轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(TransMTC)的scMetR評分顯著高于傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞(ConvTC)(圖3E)。然后，我們可視化了原發(fā)和轉(zhuǎn)移樣本中腫瘤亞群的數(shù)量和比例。雖然具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)在轉(zhuǎn)移性樣本中較多，但其比例在原發(fā)樣本中較高(圖3F和G)。
圖3。不同轉(zhuǎn)移風(fēng)險的腫瘤亞群。(A)每個分辨率下的平均剪影寬度(silwidth)圖。(B)分辨率為0.1的腫瘤亞簇的t-分布隨機鄰域嵌入(t-SNE)圖。(C)計算scMetR評分的示意圖。(D)每個腫瘤亞簇的scMetR評分的小提琴圖。(E)每個腫瘤亞群的scMetR評分的小提琴圖。(F)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶腫瘤亞群的t-SNE圖樣本，基于scMetR進(jìn)行識別。右上:主要樣本。右下:轉(zhuǎn)移性樣本。(G)腫瘤原發(fā)和轉(zhuǎn)移患者比例條形圖亞類。使用Wilcoxon檢驗*** p < 0.001
2.3. 與轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征基因
為了揭示轉(zhuǎn)移在癌癥中的作用，我們進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。我們發(fā)現(xiàn)了具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)和傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞(ConvTC)之間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，并將其定義為轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs），這些基因一共有431個。為了了解潛在的相關(guān)功能，我們對上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）進(jìn)行了功能富集分析，并確定了幾種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能，包括細(xì)胞趨化、缺氧反應(yīng)、粒細(xì)胞趨化和髓樣白細(xì)胞遷移(圖4A)。這表示上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者的臨終結(jié)果比原發(fā)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者差，表明高轉(zhuǎn)移風(fēng)險患者的生存比低轉(zhuǎn)移風(fēng)險患者的預(yù)后要差。因此，我們使用了癌癥基因組(the Cancer Genome)中患者的生存數(shù)據(jù)，通過TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫分析患者預(yù)后，驗證具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)是否具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）高表達(dá)的患者可能具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。因此，我們進(jìn)行了單樣本基因集富集分析(ssGSEA)來評估上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）的表達(dá)水平，并根據(jù)ssGSEA評分將患者分為高組和低組。生存分析結(jié)果表明，高表達(dá)上調(diào)MSGs的患者生存期更短(圖4B,C)。進(jìn)一步，我們對已發(fā)表的2例原發(fā)性具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)分析，以探索具有轉(zhuǎn)移特征的腫瘤細(xì)胞(MFTC)的空間特征。利用PCA對空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)數(shù)據(jù)進(jìn)行高變異基因(HVGs)分區(qū)。進(jìn)行無監(jiān)督聚類后，我們發(fā)現(xiàn)識別出的聚類與定義明確的組織學(xué)注釋一致(圖4D)。我們觀察到一些上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）,這些基因在之前研究中被證實可以促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞的遷移，如TFF1, TFF2和HMGA1。它們在導(dǎo)管上皮區(qū)域和癌區(qū)高表達(dá)(圖4E和4F)。通過繪制胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)切片中的細(xì)胞類型，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)優(yōu)先定位于導(dǎo)管上皮和癌區(qū)域(圖4G)。Moncada等人研究發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的導(dǎo)管細(xì)胞在導(dǎo)管上皮區(qū)域富集。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在導(dǎo)管上皮區(qū)域高表達(dá)，移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)主要分布在導(dǎo)管上皮區(qū)域，這與之前關(guān)于炎癥促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)轉(zhuǎn)移的報道一致。
圖4。分析上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因(msg)。(A)最重要的20個基因本體論(GO)術(shù)語的條形圖，按- log10p值遞減排序。x軸顯示對應(yīng)GO項富集的基因數(shù)量。紅色的項與轉(zhuǎn)移相關(guān)。(B,C)癌癥基因組圖譜(TCGA)和國際癌癥基因組聯(lián)盟(ICGC)數(shù)據(jù)集中患者的Kaplan-Meier生存曲線。(D)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)的無監(jiān)督聚類分析。顏色表示不同的區(qū)域。(E,F) TFF1和TFF2表達(dá)模式的空間解析熱圖。(G)轉(zhuǎn)移特征腫瘤細(xì)胞比例的空間分辨熱圖(MFTC)。比例由顏色表示。
2.4. 胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)細(xì)胞之間的相互作用
除了細(xì)胞內(nèi)在的信息外，細(xì)胞間的信息交流也可能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。我們使用CellChat (V1.5.0)研究所有主要細(xì)胞類型和腫瘤細(xì)胞亞群之間的信號相互作用。我們比較了在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中通過CellChat推斷腫瘤亞群總數(shù)和相互作用的強度。我們發(fā)現(xiàn)，相互作用的總數(shù)和強度在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)中最高，在移行性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞(TransMTC)中次之(圖5A和5B)。為了確定促進(jìn)轉(zhuǎn)移的信號通路，我們預(yù)測了41個信號通路中的206個顯著的配體-受體相互作用，包括ADGRE5, COLLAGEN, SPP1和ICAM。先前研究表明，ADGRE5信號通路的激活與淋巴結(jié)介入、轉(zhuǎn)移和血管侵犯相關(guān)。我們推斷ADGRE5信號通路細(xì)胞-細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)腫瘤亞群之間的相互作用強度最高，移行性轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞(TransMTC)次之(圖5C,D)。這些結(jié)果表明，與其他腫瘤亞群相比，MFTC中ADGRE5信號通路的相互作用的總數(shù)和強度以及相互作用的強度均增強，提示轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(MFTC)在腫瘤亞群中具有最高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，這與腫瘤亞群的scMetR評分一致。
圖5。主要細(xì)胞類型和腫瘤亞群的細(xì)胞間通訊。(A)來自腫瘤亞群的交互作用總數(shù)。(B)不同細(xì)胞類型之間相互作用的數(shù)量。連接單元格的線的粗細(xì)表示交互的數(shù)量。圓圈的大小表示單元格的數(shù)量。(C) ADGRE5信號通路中任意兩個細(xì)胞群之間相互作用的熱圖。右側(cè)和上方的條形圖分別代表總輸出和輸入信號強度。(D)推斷的ADGRE5信令網(wǎng)絡(luò)。左、右側(cè)圖分別顯示了對腫瘤亞群和其他細(xì)胞類型的自分泌和旁分泌信號。實圓和開圓分別代表源和目標(biāo)。圓圈的大小表示單元格的數(shù)量。連接細(xì)胞的線條的粗細(xì)表示相互作用的強度。
2.5. 潛在與轉(zhuǎn)移相關(guān)的抑制劑
手術(shù)切除胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是唯一可能治愈的治療方法，但胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)術(shù)后遠(yuǎn)處常常發(fā)生復(fù)發(fā)。因此，找到與轉(zhuǎn)移相關(guān)的抑制劑具有重要作用。為了尋找潛在的治療藥物，我們分析了來自代表藥物治療前后基因表達(dá)變化的綜合網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞標(biāo)簽庫(LINCS)的數(shù)據(jù)。使用基因集富集分析(GSEA)，我們檢測了藥物使用后上調(diào)或下調(diào)的基因中是否存在轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）。如果在藥物使用后下調(diào)的基因中存在上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs），則表明該藥物可能逆轉(zhuǎn)上調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）的表達(dá)，成為潛在的轉(zhuǎn)移抑制因子(圖6)。
圖6。基于轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）的藥物預(yù)測(A)藥物預(yù)測工作流程。(B,C)各藥物調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)。顯示上調(diào)(B)或下調(diào)(C) msg中調(diào)節(jié)前10%基因的藥物。矩形表示藥物，圓圈表示基因。每一個線和節(jié)點顏色表示一種藥物。如果一個基因可以被一種以上的藥物調(diào)節(jié)，這個節(jié)點就會被涂成紅色。(D)描述dinaciclib在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5 (CDK5)的調(diào)節(jié)。
材料與方法
3.1. 單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)處理
我們從基因表達(dá)綜合(GEO)數(shù)據(jù)庫(GSE154778)下載了已發(fā)表的胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)數(shù)據(jù)，包括10例原發(fā)樣本和6例轉(zhuǎn)移樣本。每例患者獲得的細(xì)胞數(shù)量范圍為:原發(fā)樣本為585 ~ 1570個，轉(zhuǎn)移樣本為272 ~ 2905個。數(shù)據(jù)集包含9621個原代樣本細(xì)胞和7465個轉(zhuǎn)移樣本細(xì)胞。在少于3個細(xì)胞中表達(dá)的基因被去除。我們篩選了具有40%以上線粒體基因計數(shù)、7500多個檢測到的基因和100,000多個唯一分子標(biāo)識符(UMI)的細(xì)胞。使用Seurat (V3.2.2) R軟件包進(jìn)行預(yù)處理。
3.2. 確定胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的主要細(xì)胞類型
使用帶有默認(rèn)參數(shù)的NormalizeData函數(shù)對所有通過質(zhì)量控制的單元格進(jìn)行合并和規(guī)范化。使用FindVariableGenes函數(shù)篩選出前2000個HVGs。然后，使用帶有默認(rèn)參數(shù)的ScaleData函數(shù)對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行縮放。使用Harmony軟件進(jìn)行批量校正。FindCluster函數(shù)用于查找集群。該函數(shù)返回了幾個細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇被t-SNE修飾。利用FindMarkers功能識別集群特異性的標(biāo)志基因和不同細(xì)胞類型的標(biāo)志基因。調(diào)整后的p < 0.05和|logFC| > 0.25(FC, fold change)設(shè)置為閾值。根據(jù)經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá)鑒定細(xì)胞簇的特性:腫瘤細(xì)胞的EPCAM、KRT19和KRT7; 癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)的COL1A1和ACTA2;T細(xì)胞CD3D和CD3E;巨噬細(xì)胞的CD68、CD14和AIF1。我們使用inferCNV (inferCNV of the Trinity CTAT Project: https://github.com/broadinstitute/inferCNV，于2022年4月10日訪問)推斷拷貝數(shù)變異分析。以GSA來源的正常上皮細(xì)胞(CRA001160)作為參照細(xì)胞。對于推斷cnv分析，使用以下參數(shù):cut off = 0.1，和HMM_type = ' i6 '。因此，生成熱圖來說明每個染色體的相對表達(dá)強度。
3.3重聚集腫瘤細(xì)胞用于探索腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性
我們對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了重新聚類，以細(xì)化具有不同轉(zhuǎn)移風(fēng)險的亞群。在少于3個腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的基因被切除。進(jìn)一步分析包括對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和縮放、識別hvg、批次校正和重新聚類。使用的功能與細(xì)胞類型注釋相同。通過0.1的步驟，我們以0.1到1不等的分辨率重新聚集了腫瘤細(xì)胞。在這里，我們通過silwidth來評估不同分辨率下的聚類結(jié)果，silwidth是一個衡量簇內(nèi)細(xì)胞和不同簇間細(xì)胞相似性的指標(biāo)。silwidth越大，表明同一簇的細(xì)胞具有較高的相似性。使用聚類計算每個分辨率下的平均橫徑。
3.4腫瘤細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)移風(fēng)險評估
為了估計腫瘤細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，我們?yōu)槊總€細(xì)胞提出了一個轉(zhuǎn)移風(fēng)險評分，命名為scMetR。使用以下公式對每個細(xì)胞進(jìn)行評分：
其中SEMT是ssGSEA計算的分?jǐn)?shù)，以估計來自EMT-associated gene resource (dbEMT 2.0)的基因表達(dá);SCyTo為CyToTRACE計算的細(xì)胞分化評分;r為SEMT與SCyTo的Pearson相關(guān)系數(shù)。SEMT和SCyTo被縮放到[0,1]。采用Wilcoxon檢驗計算每個腫瘤亞群與其余腫瘤亞群之間的顯著性差異。以P < 0.01為閾值。根據(jù)scMetR評分，定義了3個不同轉(zhuǎn)移風(fēng)險的腫瘤細(xì)胞亞群，包括MFTC、TransMTC和ConvTC。
3.5功能和生存分析揭示MFTC的轉(zhuǎn)移風(fēng)險
使用FindMarkers函數(shù)鑒定MFTC和ConvTC之間差異表達(dá)基因的(DEGs)，并將該類基因被定義為轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）。調(diào)整后的p < 0.05和|logFC| > 0.25被設(shè)置為閾值。利clusterProfiler (V4.2.1) R包對基因本體(GO)的生物過程(BP)類進(jìn)行功能富集分析。選擇最小計數(shù)≥1且調(diào)整后p < 0.05的項。我們從TCGA中獲取了PDAC患者的批量RNA-seq數(shù)據(jù)(http://portal.gdc.cancer.gov/，于2022年4月8日訪問)以及ICGC的AU和CA隊列
(http://dcc.icgc.org/， 2022年4月8日訪問)。對無生存數(shù)據(jù)的患者進(jìn)行篩選。最終TCGA、ICGC AU和CA隊列分別保留146、90和215個樣本用于生存分析。我們使用ssGSEA評估患者上調(diào)的差異表達(dá)基因的(DEGs)表達(dá)水平。根據(jù)ssGSEA評分將患者分為高危組和低危組。使用survminer (V0.4.9) R包的surv_cutpoint函數(shù)確定cut-off值，采用log-rank檢驗計算p值。
3.6 分析空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)以發(fā)現(xiàn)空間特征
我們從GEO數(shù)據(jù)庫(GSE111672)中訪問了PDAC的公共ST數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包含兩個主要樣本。PDAC-A樣本包含428個空間點，PDAC-B樣本包含224個空間點。在少于5個點表達(dá)的基因被去除。我們使用NormalizeData函數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，RunPCA函數(shù)執(zhí)行PCA, FindNeighbors和FindClusters對ST點進(jìn)行聚類。根據(jù)組織學(xué)特征對每個聚類進(jìn)行注釋。為了揭示MFTC的分布，我們使用條件自回歸反卷積(conditional autoregressive-based deconvolution, CARD)結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)。CARD需要包含不同細(xì)胞類型基因表達(dá)信息的scRNA-seq以及包含定位信息的ST數(shù)據(jù)。CARD通過非負(fù)因子分解框架進(jìn)行反卷積，并輸出跨空間位置的估計細(xì)胞類型組成，其中包括PDAC中所有細(xì)胞類型的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜和兩個PDAC樣本的ST數(shù)據(jù)。利用CARD (V1.0) R包的CARD_deconvolution函數(shù)計算每個空間位置的細(xì)胞類型比例。
3.7 揭示促進(jìn)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞-細(xì)胞通訊模式
為了揭示主要細(xì)胞類型之間的通訊模式，我們使用CellChat (V1.5.0)進(jìn)行細(xì)胞間通訊分析。使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)創(chuàng)建了一個CellChat對象，用于推斷不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞通信。CellChat通過評估和整合CellChat管理的人類配體受體數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)水平，計算了有生物學(xué)意義的通信模式的概率。我們遵循了官方的工作流程并應(yīng)用了預(yù)處理步驟，包括函數(shù)identifyOverExpressedGenes、identifyOverExpressedInteractions和projectData。然后，我們基于computecommunprobb, computeCommunProbPathway和aggregateNet計算了細(xì)胞類型之間潛在配體-受體相互作用。所有函數(shù)都使用默認(rèn)參數(shù)運行。
3.8 逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）表達(dá)的候選藥物的預(yù)測
我們從LINCS (http://www.Linc-sproject.org/，2022年6月2日訪問)下載了藥物治療后的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答數(shù)據(jù)集。對每種藥物，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用FC表示治療和未治療的情況。藥物的作用條件不同，如不同的胰腺癌細(xì)胞株、藥物濃度和治療次數(shù)。計算每個基因在治療組和未治療組之間的FC。然后，使用基于分層多數(shù)投票方案的原型排序表(Prototype ranking List, PRL)合并不同情況下使用相同藥物的FC排序表。各排序表中上調(diào)或下調(diào)的基因分別位于合并排序表的頂部或底部。接下來，我們使用GSEA檢測被藥物上調(diào)或下調(diào)的基因中是否存在轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs），以評估其作為轉(zhuǎn)移抑制劑的潛力。潛在轉(zhuǎn)移抑制因子上調(diào)的基因中包含下調(diào)的轉(zhuǎn)移特征基因（MSGs）。PRL通過GeneExpressionSignature (V1.38.0)包的rank merge功能實現(xiàn)。利用fgsea (V1.18.0) R包的fgsea功能進(jìn)行GSEA分析。通過設(shè)置p < 0.05的閾值來選擇候選藥物。
4 討論
胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種異質(zhì)性疾病，在腫瘤細(xì)胞中具有不同的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。先前研究表明轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致患者預(yù)后較差。因此，探索腫瘤的異質(zhì)性和潛在的轉(zhuǎn)移風(fēng)險是非常必要的，這是改善胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)預(yù)后的關(guān)鍵。在本研究中，我們基于scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定了胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中的不同細(xì)胞類型，包括腫瘤細(xì)胞，CAF, T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（圖2B）。
總之該研究確定了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的主要細(xì)胞類型，我們提出了scMetR來揭示關(guān)于轉(zhuǎn)移風(fēng)險的腫瘤異質(zhì)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，基于scMetR定義的MFTC具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。同時預(yù)測潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑。因此，我們的分析可能提供一種新的評估轉(zhuǎn)移風(fēng)險的方法，這將有助于轉(zhuǎn)移的診斷和治療。
