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單細胞核糖體技術(scRibo-seq)為蛋白組學研究帶來新變革
引文
盡管最近通過質譜分析儀在檢測蛋白質方面取得了進展，但測量單細胞內的翻譯仍然是一個重大挑戰。近日，荷蘭烏得勒支大學醫學中心的研究團隊在國際頂尖期刊Nature發表了題為“Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing”的文章。他們提高了分析的靈敏度，從而能夠分析單細胞中的核糖體譜，為確定看似相同的細胞之間的翻譯過程的顯著差異提供了進一步證據。
背景介紹
單細胞測序技術，簡單來說，就是在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組及表觀基因組水平進行測序分析的技術。傳統的測序是在多細胞基礎上進行的，實際上得到的是一堆細胞中信號的均值，丟失了細胞異質性的信息。而單細胞測序技術能夠檢出混雜樣品測序所無法得到的異質性信息，因此單細胞測序方法已經能夠深入分析多種生物的細胞類型和細胞狀態的多樣性。而鮮少有測量單細胞翻譯過程的研究。此研究團隊發現，對特定氨基酸的限制會導致核糖體在編碼該氨基酸的密碼子的子集處暫停，并且這種暫停僅在與其細胞周期狀態相關的細胞亞群中觀察到。最后，他們證明了這項技術適用于罕見的原發性腸內分泌細胞。該研究有重要的開創性成果：1）證明單細胞核糖體測序(scRibo-seq)能夠實現單密碼子的分辨率；2）極大地提高了單細胞核糖體檢測的敏感性，使得在單個細胞中對核糖體進行分析成為可能。這項技術也是第一次證明了看似相同的細胞，他們的翻譯過程可能存在顯著多樣性。
主要研究內容及結果
1.scRibo-seq可用于解析單細胞翻譯
首先，研究人員通過scRibo-seq技術將核酸酶印跡、小RNA文庫的構建和富集相結合，用來測量單細胞中的翻譯動力學(圖1a)。通過將這一過程直接整合到一個反應體系中，發現能夠顯著提高現有核糖體分析技術的靈敏度和可擴展性。步驟簡述如下：1）將單個活細胞分選到含有環己酰亞胺的裂解緩沖液中，以穩定和停止轉錄物上的核糖體；2）暴露的核糖核酸（RNA）隨后被微球菌核酸酶(MNase)消化，產生的核糖體保護足跡(RPFs)被釋放；3）這些足跡通過連接含有唯一分子標識符(UMI)的引物位點的接頭而轉化為測序庫，用于隨后的cDNA合成和聚合酶鏈反應（PCR）；4）最后將反應產物匯集并選擇合適的PCR產物，以富集符合典型RPF長度的插入片段進行測序。
然后，為了驗證這種方法，研究人員從HEK 293T和hTERT RPE-1細胞系構建了scRibo-seq文庫。得到的單細胞文庫檢測到3348±15個基因，每個細胞具有10451±85個獨特的讀數，并表現出核糖體分析實驗特有的幾個特征(圖1b，c)。隨后發現，第一，片段主要映射到編碼序列(CDSs)(圖1b，c)，其5?末端在起始密碼子上游約15個核苷酸位置顯著富集，在終止密碼子上游約18個核苷酸位置顯著減少(圖1b，左和右)。第二，起始密碼子和終止密碼子的局部密度都增加了(圖1b)，它們來源于翻譯起始和終止階段的核糖體。第三，片段的5?末端顯示出沿CDS的清晰但適度的3個核算酸周期性(圖1b)。最后，對常見污染物、不同生物類型以及蛋白質編碼基因的非翻譯區(UTRs)和CDS的定位頻率都與常規核糖體分析方法相似。
圖1.scRibo-seq測量單細胞翻譯狀態
a. scRibo-seq工作流程示意圖。（BCD,條形碼;FACS，熒光激活細胞分選）；b. 起始密碼子周圍(左)、CDS(中)和終止密碼子周圍(右)沿元基因區域排列的核糖體印跡折痕變化熱圖，顯示了每次讀取的5末端的映射坐標；c. RPF定位頻率在蛋白編碼轉錄本5個UTR、CDS和3個UTR區域的區域長度歸一化分布。
2.單細胞翻譯的異質性
研究團隊通過在分選前從HEK293T培養基中去除精氨酸和亮氨酸，然后在3和6?小時后比較預測的E、P和A位點密碼子占位的變化，觀察處理后特異性的停頓現象，驗證了scRibo-seq測量翻譯動力學 (圖2A)。核糖體圖譜顯示，這種暫停表現為受影響密碼子的足跡密度增加。
值得注意的是，在每種限制條件下，只有一部分細胞表現出暫停反應(155個細胞中有41個來自精氨酸限制，202個細胞中有24個來自亮氨酸限制)。利用每個CDS的RPF計數對細胞進行聚類，識別出由細胞周期標記基因區分的4個簇(圖2C，f)。在這些簇的基礎上，研究人員發現細胞周期狀態、氨基酸限制對翻譯暫停存在顯著影響。在精氨酸限制下暫停的細胞中，絕大多數(89.7%)處于早期(第2群，5個細胞)或晚期(第1群，30個細胞)S期，而對亮氨酸限制有反應的細胞與任何群集(UUA：P?=?0.33)(圖2D)沒有顯著關聯
核糖體在單個基因上的停頓位置在單細胞核糖體測序數據中也很明顯。如，H3C2是在精氨酸缺乏下CGC暫停增加的基因之一，檢查H3C2上的RPF密度，揭示了幾個暫停熱點(圖2e，g)。這些區域中最突出的包括兩個連續的CGC密碼子(圖2e)，潛在地解釋了與該轉錄物上的其他相同密碼子相比，該位置的密度增加的原因。此外，這些重復密碼子可能導致圖2b中所示的A和P位點下游的CGC和CGU占有率的增加。
圖 2:氨基酸限制下的核糖體功能暫停
a.核糖體出口(E)、肽基(P)和氨基酰(a)位點的密碼子占位（FC：褶皺變化）;b.核糖體活性位點相關的密碼子占位折疊變化的熱圖。c.單細胞RPF庫的UMAP (n = 421個細胞)顯示導出的簇(虛線輪廓)和限制條件(點顏色)。UMAP和聚類是通過每個CDS的RPF計數來確定的。d. UMAP分析顯示，在精氨酸-(上)和亮氨酸-(下)限制條件下，密碼子占位的平均對數倍變化。e. 根據細胞整體精氨酸停頓進行分類和分組的細胞沿H3C2切片p位點占位的平均值。f. 熱圖顯示每個細胞簇的最高標記基因每CDS的RPF計數。d、g. 顯示，熱圖顯示沿H3C2的單細胞p位占用，細胞按平均CGC和CGU占位排序
3.翻譯調控在細胞周期中的變化
翻譯調控以前被認為是一種重要的細胞周期控制機制，然而這些研究只是粗略地解析了細胞周期的主要狀態，并且依賴于用同樣作用于翻譯機制的方法來捕獲或同步細胞。此次研究人員從3276個表達熒光泛素化的細胞周期指示物(FUCCI)的單個hTERT-RPE-1細胞中產生scRibo-seq文庫，所有FUCCI從不同的細胞周期中獲取(圖3a，f)。利用每個CDS的RPF計數對單細胞進行聚類，確定了八個群體(圖3b)。通過偽時序分析進一步解決了細胞周期中的這一進程，通過均勻流形近似和投影(UMAP)(圖3c)建立了和FUCCI標記(圖3h)相似的軌跡，并鑒定了在翻譯動力學中存在顯著差異的1853個基因。
他們發現在細胞周期中出現頻率變化的密碼子表現出位點特異性變化，有四個密碼子的A位點占位增加(GAA、GAG和AUA)或減少(CGA)，而其他活性位點保持不變(圖3i)。其中，A位點的停頓比GAA位點的增加更為顯著，且具有階段特異性(圖3i，j)。然而，并不是所有的密碼子都遵循同樣的趨勢。例如，處于有絲分裂晚期的細胞表現出比有絲分裂早期的細胞更明顯的AUA暫停(圖3i，k)，而與其他階段相比，有絲分裂和G0細胞的CGA暫停減少(圖3i)。
A位點暫停的變化是全局性的，影響了大多數翻譯基因。比較每個簇和背景之間RPFA位點GAA密碼子出現的基因頻率，研究人員發現大多數基因在有絲分裂期間經歷了GAA暫停的增加(圖3M)。這些A位點暫停的階段特異性變化可能反映了有絲分裂期間翻譯延伸動力學的全局變化。
圖3. 細胞周期中的翻譯暫停
a、e. 通過每個CDS的RPF計數測定UMAPs(n=3276個細胞)，包括細胞組分(a).細胞簇(b).偽時間軌跡 (c).單體Kusabira-Orange-2(mKO2)CDT1標記熒光 (d).和單體Azami-Green(mAG)GMNNFUCCI標記熒光.(e)f-h標記(n=3276個細胞)的散點圖，顏色表示細胞組分(f)，細胞簇(g)和假時間軌跡(h)，如a-c.i，熱圖顯示基于細胞周期進展排序的單個細胞中核糖體位點特定的密碼子暫停；j,k. UMAP分析顯示GAA暫停(j)和AUA暫停(k)；I. 熱圖顯示沿MYL6CDS的RPFA位點分布。細胞的排列是基于細胞周期的進程。GAA密碼子在圖的頂部用標記表示。m. 散點圖顯示背景下每個細胞簇的基因A位點頻率的折疊變化。
4. scRibo-seq在罕見細胞中的應用
此外，在細胞系上證明了scRibo-seq后，研究人員為原代小鼠腸道內分泌(EEC)細胞生成了核糖體圖譜，EEC細胞是胃腸上皮(不到1%的細胞)中的一種稀有細胞（圖4）。最后通過已建立的激素標記基因的翻譯，確定了代表主要EEC細胞類型的8個簇(圖4)。結果發現GAA暫停的細胞群只出現在腸嗜鉻細胞群的晚期(29個細胞中有6個)，而CAG暫停的細胞分布在眾多細胞群之間。
圖4. 小鼠原代腸EEC細胞的單細胞核糖體分析
全文總結
此研究通過scRibo-seq技術測量單細胞水平的翻譯過程，填補了現有的單細胞基因組學技術的空白，scRibo-seq提供了一種無標記和無轉基因的核糖體分析方法，其靈敏度和分辨率可測量單個細胞群體中特定轉錄本上的核糖體行為，分辨率可達到單個密碼子。與最近描述的Ribo-STAMP26相比，scRibo-seq提供了翻譯的瞬間快照，具有單密碼子分辨率，不需要表達外源性融合蛋白。這些獨特的能力使我們能夠詳細地研究哺乳動物細胞周期中的翻譯，為有絲分裂期間翻譯調控的廣泛改變提供了證據。此外，研究人員將scRibo-seq應用于原代EEC細胞，證明scRibo-seq可以直接應用于復雜的原代樣本，從而能夠測量稀有細胞群體中的翻譯動力學。
