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單細(xì)胞核糖體技術(shù)(scRibo-seq)為蛋白組學(xué)研究帶來(lái)新變革
引文
盡管最近通過(guò)質(zhì)譜分析儀在檢測(cè)蛋白質(zhì)方面取得了進(jìn)展，但測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)的翻譯仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。近日，荷蘭烏得勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂尖期刊Nature發(fā)表了題為“Single-cell Ribo-seq reveals cell cycle-dependent translational pausing”的文章。他們提高了分析的靈敏度，從而能夠分析單細(xì)胞中的核糖體譜，為確定看似相同的細(xì)胞之間的翻譯過(guò)程的顯著差異提供了進(jìn)一步證據(jù)。
背景介紹
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是在單個(gè)細(xì)胞水平上，對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀基因組水平進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù)。傳統(tǒng)的測(cè)序是在多細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行的，實(shí)際上得到的是一堆細(xì)胞中信號(hào)的均值，丟失了細(xì)胞異質(zhì)性的信息。而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠檢出混雜樣品測(cè)序所無(wú)法得到的異質(zhì)性信息，因此單細(xì)胞測(cè)序方法已經(jīng)能夠深入分析多種生物的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)的多樣性。而鮮少有測(cè)量單細(xì)胞翻譯過(guò)程的研究。此研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)特定氨基酸的限制會(huì)導(dǎo)致核糖體在編碼該氨基酸的密碼子的子集處暫停，并且這種暫停僅在與其細(xì)胞周期狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞亞群中觀察到。最后，他們證明了這項(xiàng)技術(shù)適用于罕見(jiàn)的原發(fā)性腸內(nèi)分泌細(xì)胞。該研究有重要的開(kāi)創(chuàng)性成果：1）證明單細(xì)胞核糖體測(cè)序(scRibo-seq)能夠?qū)崿F(xiàn)單密碼子的分辨率；2）極大地提高了單細(xì)胞核糖體檢測(cè)的敏感性，使得在單個(gè)細(xì)胞中對(duì)核糖體進(jìn)行分析成為可能。這項(xiàng)技術(shù)也是第一次證明了看似相同的細(xì)胞，他們的翻譯過(guò)程可能存在顯著多樣性。
主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
1.scRibo-seq可用于解析單細(xì)胞翻譯
首先，研究人員通過(guò)scRibo-seq技術(shù)將核酸酶印跡、小RNA文庫(kù)的構(gòu)建和富集相結(jié)合，用來(lái)測(cè)量單細(xì)胞中的翻譯動(dòng)力學(xué)(圖1a)。通過(guò)將這一過(guò)程直接整合到一個(gè)反應(yīng)體系中，發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高現(xiàn)有核糖體分析技術(shù)的靈敏度和可擴(kuò)展性。步驟簡(jiǎn)述如下：1）將單個(gè)活細(xì)胞分選到含有環(huán)己酰亞胺的裂解緩沖液中，以穩(wěn)定和停止轉(zhuǎn)錄物上的核糖體；2）暴露的核糖核酸（RNA）隨后被微球菌核酸酶(MNase)消化，產(chǎn)生的核糖體保護(hù)足跡(RPFs)被釋放；3）這些足跡通過(guò)連接含有唯一分子標(biāo)識(shí)符(UMI)的引物位點(diǎn)的接頭而轉(zhuǎn)化為測(cè)序庫(kù)，用于隨后的cDNA合成和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）；4）最后將反應(yīng)產(chǎn)物匯集并選擇合適的PCR產(chǎn)物，以富集符合典型RPF長(zhǎng)度的插入片段進(jìn)行測(cè)序。
然后，為了驗(yàn)證這種方法，研究人員從HEK 293T和hTERT RPE-1細(xì)胞系構(gòu)建了scRibo-seq文庫(kù)。得到的單細(xì)胞文庫(kù)檢測(cè)到3348±15個(gè)基因，每個(gè)細(xì)胞具有10451±85個(gè)獨(dú)特的讀數(shù)，并表現(xiàn)出核糖體分析實(shí)驗(yàn)特有的幾個(gè)特征(圖1b，c)。隨后發(fā)現(xiàn)，第一，片段主要映射到編碼序列(CDSs)(圖1b，c)，其5?末端在起始密碼子上游約15個(gè)核苷酸位置顯著富集，在終止密碼子上游約18個(gè)核苷酸位置顯著減少(圖1b，左和右)。第二，起始密碼子和終止密碼子的局部密度都增加了(圖1b)，它們來(lái)源于翻譯起始和終止階段的核糖體。第三，片段的5?末端顯示出沿CDS的清晰但適度的3個(gè)核算酸周期性(圖1b)。最后，對(duì)常見(jiàn)污染物、不同生物類型以及蛋白質(zhì)編碼基因的非翻譯區(qū)(UTRs)和CDS的定位頻率都與常規(guī)核糖體分析方法相似。
圖1.scRibo-seq測(cè)量單細(xì)胞翻譯狀態(tài)
a. scRibo-seq工作流程示意圖。（BCD,條形碼;FACS，熒光激活細(xì)胞分選）；b. 起始密碼子周圍(左)、CDS(中)和終止密碼子周圍(右)沿元基因區(qū)域排列的核糖體印跡折痕變化熱圖，顯示了每次讀取的5末端的映射坐標(biāo)；c. RPF定位頻率在蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本5個(gè)UTR、CDS和3個(gè)UTR區(qū)域的區(qū)域長(zhǎng)度歸一化分布。
2.單細(xì)胞翻譯的異質(zhì)性
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)在分選前從HEK293T培養(yǎng)基中去除精氨酸和亮氨酸，然后在3和6?小時(shí)后比較預(yù)測(cè)的E、P和A位點(diǎn)密碼子占位的變化，觀察處理后特異性的停頓現(xiàn)象，驗(yàn)證了scRibo-seq測(cè)量翻譯動(dòng)力學(xué) (圖2A)。核糖體圖譜顯示，這種暫停表現(xiàn)為受影響密碼子的足跡密度增加。
值得注意的是，在每種限制條件下，只有一部分細(xì)胞表現(xiàn)出暫停反應(yīng)(155個(gè)細(xì)胞中有41個(gè)來(lái)自精氨酸限制，202個(gè)細(xì)胞中有24個(gè)來(lái)自亮氨酸限制)。利用每個(gè)CDS的RPF計(jì)數(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類，識(shí)別出由細(xì)胞周期標(biāo)記基因區(qū)分的4個(gè)簇(圖2C，f)。在這些簇的基礎(chǔ)上，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期狀態(tài)、氨基酸限制對(duì)翻譯暫停存在顯著影響。在精氨酸限制下暫停的細(xì)胞中，絕大多數(shù)(89.7%)處于早期(第2群，5個(gè)細(xì)胞)或晚期(第1群，30個(gè)細(xì)胞)S期，而對(duì)亮氨酸限制有反應(yīng)的細(xì)胞與任何群集(UUA：P?=?0.33)(圖2D)沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)
核糖體在單個(gè)基因上的停頓位置在單細(xì)胞核糖體測(cè)序數(shù)據(jù)中也很明顯。如，H3C2是在精氨酸缺乏下CGC暫停增加的基因之一，檢查H3C2上的RPF密度，揭示了幾個(gè)暫停熱點(diǎn)(圖2e，g)。這些區(qū)域中最突出的包括兩個(gè)連續(xù)的CGC密碼子(圖2e)，潛在地解釋了與該轉(zhuǎn)錄物上的其他相同密碼子相比，該位置的密度增加的原因。此外，這些重復(fù)密碼子可能導(dǎo)致圖2b中所示的A和P位點(diǎn)下游的CGC和CGU占有率的增加。
圖 2:氨基酸限制下的核糖體功能暫停
a.核糖體出口(E)、肽基(P)和氨基酰(a)位點(diǎn)的密碼子占位（FC：褶皺變化）;b.核糖體活性位點(diǎn)相關(guān)的密碼子占位折疊變化的熱圖。c.單細(xì)胞RPF庫(kù)的UMAP (n = 421個(gè)細(xì)胞)顯示導(dǎo)出的簇(虛線輪廓)和限制條件(點(diǎn)顏色)。UMAP和聚類是通過(guò)每個(gè)CDS的RPF計(jì)數(shù)來(lái)確定的。d. UMAP分析顯示，在精氨酸-(上)和亮氨酸-(下)限制條件下，密碼子占位的平均對(duì)數(shù)倍變化。e. 根據(jù)細(xì)胞整體精氨酸停頓進(jìn)行分類和分組的細(xì)胞沿H3C2切片p位點(diǎn)占位的平均值。f. 熱圖顯示每個(gè)細(xì)胞簇的最高標(biāo)記基因每CDS的RPF計(jì)數(shù)。d、g. 顯示，熱圖顯示沿H3C2的單細(xì)胞p位占用，細(xì)胞按平均CGC和CGU占位排序
3.翻譯調(diào)控在細(xì)胞周期中的變化
翻譯調(diào)控以前被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞周期控制機(jī)制，然而這些研究只是粗略地解析了細(xì)胞周期的主要狀態(tài)，并且依賴于用同樣作用于翻譯機(jī)制的方法來(lái)捕獲或同步細(xì)胞。此次研究人員從3276個(gè)表達(dá)熒光泛素化的細(xì)胞周期指示物(FUCCI)的單個(gè)hTERT-RPE-1細(xì)胞中產(chǎn)生scRibo-seq文庫(kù)，所有FUCCI從不同的細(xì)胞周期中獲取(圖3a，f)。利用每個(gè)CDS的RPF計(jì)數(shù)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行聚類，確定了八個(gè)群體(圖3b)。通過(guò)偽時(shí)序分析進(jìn)一步解決了細(xì)胞周期中的這一進(jìn)程，通過(guò)均勻流形近似和投影(UMAP)(圖3c)建立了和FUCCI標(biāo)記(圖3h)相似的軌跡，并鑒定了在翻譯動(dòng)力學(xué)中存在顯著差異的1853個(gè)基因。
他們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期中出現(xiàn)頻率變化的密碼子表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性變化，有四個(gè)密碼子的A位點(diǎn)占位增加(GAA、GAG和AUA)或減少(CGA)，而其他活性位點(diǎn)保持不變(圖3i)。其中，A位點(diǎn)的停頓比GAA位點(diǎn)的增加更為顯著，且具有階段特異性(圖3i，j)。然而，并不是所有的密碼子都遵循同樣的趨勢(shì)。例如，處于有絲分裂晚期的細(xì)胞表現(xiàn)出比有絲分裂早期的細(xì)胞更明顯的AUA暫停(圖3i，k)，而與其他階段相比，有絲分裂和G0細(xì)胞的CGA暫停減少(圖3i)。
A位點(diǎn)暫停的變化是全局性的，影響了大多數(shù)翻譯基因。比較每個(gè)簇和背景之間RPFA位點(diǎn)GAA密碼子出現(xiàn)的基因頻率，研究人員發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在有絲分裂期間經(jīng)歷了GAA暫停的增加(圖3M)。這些A位點(diǎn)暫停的階段特異性變化可能反映了有絲分裂期間翻譯延伸動(dòng)力學(xué)的全局變化。
圖3. 細(xì)胞周期中的翻譯暫停
a、e. 通過(guò)每個(gè)CDS的RPF計(jì)數(shù)測(cè)定UMAPs(n=3276個(gè)細(xì)胞)，包括細(xì)胞組分(a).細(xì)胞簇(b).偽時(shí)間軌跡 (c).單體Kusabira-Orange-2(mKO2)CDT1標(biāo)記熒光 (d).和單體Azami-Green(mAG)GMNNFUCCI標(biāo)記熒光.(e)f-h標(biāo)記(n=3276個(gè)細(xì)胞)的散點(diǎn)圖，顏色表示細(xì)胞組分(f)，細(xì)胞簇(g)和假時(shí)間軌跡(h)，如a-c.i，熱圖顯示基于細(xì)胞周期進(jìn)展排序的單個(gè)細(xì)胞中核糖體位點(diǎn)特定的密碼子暫停；j,k. UMAP分析顯示GAA暫停(j)和AUA暫停(k)；I. 熱圖顯示沿MYL6CDS的RPFA位點(diǎn)分布。細(xì)胞的排列是基于細(xì)胞周期的進(jìn)程。GAA密碼子在圖的頂部用標(biāo)記表示。m. 散點(diǎn)圖顯示背景下每個(gè)細(xì)胞簇的基因A位點(diǎn)頻率的折疊變化。
4. scRibo-seq在罕見(jiàn)細(xì)胞中的應(yīng)用
此外，在細(xì)胞系上證明了scRibo-seq后，研究人員為原代小鼠腸道內(nèi)分泌(EEC)細(xì)胞生成了核糖體圖譜，EEC細(xì)胞是胃腸上皮(不到1%的細(xì)胞)中的一種稀有細(xì)胞（圖4）。最后通過(guò)已建立的激素標(biāo)記基因的翻譯，確定了代表主要EEC細(xì)胞類型的8個(gè)簇(圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAA暫停的細(xì)胞群只出現(xiàn)在腸嗜鉻細(xì)胞群的晚期(29個(gè)細(xì)胞中有6個(gè))，而CAG暫停的細(xì)胞分布在眾多細(xì)胞群之間。
圖4. 小鼠原代腸EEC細(xì)胞的單細(xì)胞核糖體分析
全文總結(jié)
此研究通過(guò)scRibo-seq技術(shù)測(cè)量單細(xì)胞水平的翻譯過(guò)程，填補(bǔ)了現(xiàn)有的單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)的空白，scRibo-seq提供了一種無(wú)標(biāo)記和無(wú)轉(zhuǎn)基因的核糖體分析方法，其靈敏度和分辨率可測(cè)量單個(gè)細(xì)胞群體中特定轉(zhuǎn)錄本上的核糖體行為，分辨率可達(dá)到單個(gè)密碼子。與最近描述的Ribo-STAMP26相比，scRibo-seq提供了翻譯的瞬間快照，具有單密碼子分辨率，不需要表達(dá)外源性融合蛋白。這些獨(dú)特的能力使我們能夠詳細(xì)地研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期中的翻譯，為有絲分裂期間翻譯調(diào)控的廣泛改變提供了證據(jù)。此外，研究人員將scRibo-seq應(yīng)用于原代EEC細(xì)胞，證明scRibo-seq可以直接應(yīng)用于復(fù)雜的原代樣本，從而能夠測(cè)量稀有細(xì)胞群體中的翻譯動(dòng)力學(xué)。
