掃碼聯系客服
十一月份最新發表在《nature communication》的三陰性乳腺癌亞型研究再次為亞型相關研究提供了新的思路，乳腺癌的亞型研究思路一直都是一個研究熱點，先前的研究思路也已經較為成熟，這篇文章將從另一個角度為研究人員分析，乳腺結合先前已經做過的研究來做自己的分析，三陰性乳腺癌(TNBC)亞型包括兩個基底樣(BL1, BL2)，一個間充質(M)和一個腔內雄激素受體(LAR)亞型。通過對突變、拷貝數、轉錄組學、表觀遺傳學、蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學模式的綜合分析，研究人員描述了TNBC亞型的基因組格局。間充質亞型腫瘤表現出高突變量、基因組不穩定、缺乏免疫細胞、低PD-L1表達、整體DNA甲基化降低和抗原提呈基因轉錄抑制。
研究人員證實，主要組織相容性復合體I (MHC-I)被多冠抑制因子復合體2 (polycomb suppressor complex 2, PRC2)的H3K27me3修飾所轉錄抑制。在小鼠腫瘤模型中，PRC2亞基EZH2或EED的藥理抑制可以恢復MHC-I的表達，并提高化療療效，這為在PD-L1陰性間充質腫瘤中使用PRC2抑制劑提供了理論依據。免疫細胞組成的亞型特異性差異和不同的遺傳/藥理學脆弱性提示了TNBC的額外治療策略。
摘要：
三陰性乳腺癌(TNBC)是一種異質性疾病，定義為雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達缺失，人上皮生長因子受體2 (HER2)擴增。這些受體表達的缺乏和高頻驅動改變阻礙了TNBC靶向治療的發展。目前，化療和免疫檢查點阻斷是大多數TNBC患者的主要治療選擇。TNBC顯示轉錄多樣性，至少有四種腫瘤固有亞型，包括兩種基底樣(BL1, BL2)，一種間充質(M)和一種管腔雄激素受體(LAR)亞型。每一種亞型表現出獨特的生物學特性和對標準護理化療的不同反應。雄激素受體(AR)、PI3K/AKT、EGFR、Ras/MAPK、JAK/ STAT和NOTCH通路在一小部分TNBC中發生改變，并已進行了相關的臨床研究。盡管在腫瘤表征方面取得了進展，但目前的生物學見解尚未轉化為具體的治療方法，除了PARP抑制劑或BRCA1/2種生殖系載體中的鉑劑。最近，針對PD1/PD-L1的免疫檢查點抑制劑被證實對TNBC有效，并已獲得fda批準，用于與白蛋白-紫杉醇2聯合治療轉移性TNBC。然而，只有一小部分患者對免疫檢查點抑制有反應，這些反應與PD-L1表達和腫瘤突變負荷(TMB)相關。TNBC亞型與不同的免疫細胞組成有關;尤其引人注目的是間充質亞型(m亞型)中缺乏免疫細胞。這些數據表明間充質TNBC可能已經發展出逃避免疫監視的機制。在這里，研究人員展示了一個全面的亞型特異性分析，突變，拷貝數，基因表達，DNA甲基化，癌癥基因組圖譜(TCGA)和臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟(CPTAC)中TNBC患者的蛋白質組學數據，確定了免疫逃逸的潛在機制，并進一步了解TNBC亞型的生物學特性、TNBC細胞系和動物模型識別遺傳和藥理學弱點，并確定TNBC患者的潛在治療策略。
結果：
病理引導的多組學鑒別TNBC和TNBC亞型之間的臨床病理差異
患者來自TCGA, CPTAC，國際乳腺癌分子分類聯盟(METABRIC)，以及MET500，使用臨床定義的ER, PR和HER2腫瘤的表達分布指導的基因組數據(圖a)。發現TCGA組有192例TNBC患者(17.5%)，CPTAC組有27例(25.7%)，348個來自METABRIC 40(17.6%)和轉移性患者(43.5%)群來自MET500 TNBC，結合不同蛋白，突變以及RNA表達情況，研究人員可以看到每種亞型的特異性。接下來又檢查了預后是否因亞型而異，通過BL1亞型的風險最低(風險比，HR 0.81)， BL2亞型的發展風險最高(風險比，HR 1.87)(圖b，c)。免疫的角度，免疫細胞的存在與生存相關，免疫細胞估值較低的tnbc傾向于更短的無進展間隔(PFI)，而基質免疫細胞腫瘤顯示最低的復發風險(圖d，e)。
無監督聚類和單細胞RNA分析揭示了腫瘤內部的異質性。根據與其他人之前已經確定了4到6個不同的轉錄TNBC亞型，研究人員對TGCA TNBC腫瘤進行無監督k-means一致聚類。確定最優數量的集群5基于共識的曲線下的面積分布函數(圖 a、b)。注釋的共識集群亞型相關性表明,集群1主要是免疫調節(IM)亞型，集群2包括腫瘤混合M和 BL1亞型,聚類3主要為BL1和IM亞型，聚類4主要為BL2亞型，聚類5幾乎全部為LAR亞型(圖c)。有趣的是，間充質簇(1和2)都缺乏IM亞型調用，這與該亞型6大腫瘤中腫瘤免疫浸潤的情況一致。由于有些腫瘤與兩個亞型相關，研究人員選擇一致性聚類相關性低的腫瘤作為潛在的混合亞型腫瘤。混合亞型腫瘤顯示出顯著其降低了TNBC亞型和共識聚類的總生存率(圖d)，為了確定單個細胞如何促成混合亞型，研究人員評估了6例原發性TNBC患者的單細胞RNA測序(scRNA-seq)(圖a)。使用淋巴細胞、單核細胞、肌上皮細胞、內皮細胞和上皮細胞標記物，又識別出了腫瘤上皮細胞(圖b)。研究人員對單個細胞進行TNBC分型，并對代表偽體分析的每個腫瘤的所有細胞進行聚合表達。UMAP圖顯示四種TNBC亞型不同的細胞簇(圖c)。個體腫瘤的亞型構成因患者而異，但偽體分析的亞型相關強度與個體細胞亞型組成相關(圖d)。這些數據提供了證據，證明具有多重相關性的腫瘤是由混合亞型組成的，并可能反映了腫瘤細胞的可塑性，允許細胞狀態之間的轉換。
通過整合基因組特征分析鑒定TNBC亞型特征
圖1
圖2
圖3
為了確定額外的亞型特異性特征和潛在的治療策略，研究人員評估了TNBC腫瘤中按亞型分層的TCGA中的DNA突變、拷貝數、基因表達、蛋白和磷蛋白表達、DNA甲基化和染色質可及性(圖1a)。由于TNBC腫瘤很少是純的，而是一個連續體的混合物或一部分，所以使用亞型相關強度而不是二元亞型分配來進行所有的鑒別檢測。TNBC樣本中除LAR腫瘤中HER2亞型富集外，絕大多數為PAM50檢測的基底樣(basal)(圖1b)。M亞型的間質和免疫細胞估計值較低，這表明在這些腫瘤中缺乏免疫細胞。為了更好地了解TNBC腫瘤的細胞組成，研究人員使用來自TNBC和正常乳腺上皮細胞的scRNA-seq數據解旋了大量RNA信號。除了BL2亞型的肌上皮細胞和基質細胞富集外，所有亞型主要由上皮細胞組成(圖1b)。m亞型缺乏淋巴細胞和單核細胞特征。正常上皮細胞估計進一步支持BL2-亞型的肌上皮細胞起源和BL1-和LARsubtypes21的腔內祖細胞(L1.2)起源。激素反應的l2型細胞幾乎只存在于LAR亞型，支持LAR腫瘤中更分化的雄激素受體(AR)驅動的細胞類型。
類似的反褶積方法用于確定免疫細胞組成，并支持M亞型中不存在抗原呈遞和效應免疫細胞類。TNBC腫瘤表現出不同的基因表達模式。由于間充質腫瘤與免疫細胞標記降低相關，所以評估了已知的免疫細胞標記物、免疫檢查點表達和抗原呈提表達，并觀察到間充質亞型的表達降低(圖1b)。在METABRIC組的原發腫瘤和MET500組的轉移性腫瘤中觀察到類似的腫瘤譜模式(圖2a，f)。檢測了TNBC亞型的DNA突變和拷貝數改變(CNAs)。與其他癌癥類型類似，TNBC患者較高的TMB 顯著的無進展間隔(PFI)優于突變負荷較低的患者。按亞型劃分，與BL2和LAR亞型相比，BL1和M亞型每個腫瘤有更多的突變。然而，盡管BL1和M腫瘤均顯示較高的突變負擔，但只有BL1腫瘤顯與較好的生存期相關，這表明在標準化療后亞型特異性長期預后方面存在差異。
與乳腺癌的過去研究結果一致，TP53的改變是頻繁的(95%突變/CNA)，并分布在所有亞型中，而激活PIK3CA和ERBB2突變豐富，DNA修復和細胞周期改變在LAR亞型中基本缺失(圖1b)。激活的MAPK通路突變相對較少，然而，它們在BL2亞型中顯著富集。大約19.7%的TNBC腫瘤有一個調節表觀遺傳修飾的基因的功能缺失突變。與其他亞型相比,M-subtype腫瘤有更高比例的表觀遺傳修飾符突變和明顯豐富ASXL基因家族突變。此外，M亞型在BAF SWI/SNF核小體重塑復合體成員中富含功能缺失突變(圖1b)。這些觀察表明，這些染色質重塑基因的功能缺失可能導致M亞型腫瘤中PRC2活性的增加。
DNA的突變模式來源于腫瘤發生過程中導致不同生物學變化的突變過程。因此，研究人員研究了TNBC亞型中單個堿基替換signature的模式。在TNBC中鑒定了四種顯著的DNA突變特征(APOBEC胞苷脫氨酶、5-甲基胞嘧啶自發脫氨、DNA錯配修復缺陷和同源重組修復缺陷DNA)(圖3d)。這些特征先前在沒有亞型關聯的乳腺癌中被分析過，然而研究人員的數據表明，通過同源重組標記的缺陷DNA修復在BL1-和m亞型中明顯更高(圖3e)。為了識別與每個亞型相關的復發灶性染色體CNAs。總體而言，M亞型腫瘤顯示的CNAs程度最大。符合之前的研究(圖3 g ，h)。DNA修復基因的缺失在M-subtype更頻繁地觀察到。雖然PD-L1的擴增發生在所有亞型中，但與其他亞型相比，m亞型中β -2微球蛋白(B2M)的缺失更為頻繁，這可能降低抗原呈現，并影響免疫檢查點治療的療效。
同時免疫細胞的存在及其在TNBC中的空間分辨率已被證明可以預測預后結果。為了確定腫瘤微環境中免疫細胞是否存在空間差異，研究人員根據之前定義的標準對存檔的H&E圖像進行評分，并將腫瘤分組。M亞型更容易被識別為margin restricted (MR)和immune desert (ID)
的分組，RNA-seq缺乏免疫細胞轉錄的signature的數據提示該亞型腫瘤免疫識別缺陷(圖1c, d)。
基因表達分析和磷蛋白分析數據確定了獨特的亞型特異性靶向途徑
圖1
圖2
對TNBC亞型的差異表達基因進行了通路單樣本基因集變異分析(GSVA)(圖1a)。BL1亞型在MYC靶點和細胞周期檢查點通路中顯示富集。lar亞型在雄激素反應、脂肪酸代謝和氧化磷酸化方面表現出富集。BL2-和M亞型在EMT和TGF-β通路中均富集。除m亞型外，所有亞型都表現出更高的免疫細胞途徑富集(抗原加工和呈遞、干擾素- γ反應和T細胞信號)。為了確定這些亞型特異性的轉錄通路是否導致活性蛋白信號，研究人員分析了CPTAC中TNBC腫瘤的RNA和蛋白質水平(圖1b, c)。
同時，總體而言TNBC亞型表現出與RNA相似的蛋白通路富集，在BL1腫瘤中細胞周期富集。BL2和M腫瘤中的EMT和整合素通路，以及LAR腫瘤中富集的代謝通路(圖2a)。M亞型腫瘤中始終缺乏免疫細胞標志物和抗原呈遞(圖1c)。綜上所述，這些分析突出了TNBC亞型中潛在生物學和不同免疫細胞狀態的多樣性。為了更好地理解蛋白質信號的差異，研究人員檢測了參與DNA修復/細胞周期、PI3K、MAPK和抗原提呈途徑的關鍵蛋白殘基的磷酸化水平。DNA修復和細胞周期信號通路在TNBC亞型之間顯示出有趣的差異(圖2b)。雖然在RNA表達上沒有觀察到，但M亞型表現出DNA修復信號的增加，證據是ATR (T1989)、ATRIP (S224/S239)和ATM (S1981)的磷酸化水平升高。BL1和M亞型梭形檢查點增加，PLK1蛋白和磷酸化水平增加(T210)。BL1亞型顯示更高的CCNB2蛋白，BL1和M亞型顯示更高的磷酸化CDK1 (T14/T15)，表明這些亞型可能從CDK1/2抑制劑中獲益更多。相比之下，BL2亞型的CDK6蛋白水平更高。在BL2和lar亞型中，RB (S807/T826/S795)磷酸化水平較高，而E2F蛋白水平較低，表明G1S檢查點完整，可能對CDK4/6抑制敏感。PI3K/mTOR通路主要在BL2-和lar -亞型中被激活(圖2c)，這通過磷酸化AKT1(T308/S473)和AKT2 (S474)的增加得到證實。AKT活化可能與PDK1蛋白升高和ERBB2 (T1240)信號通路激活有關。然而，LAR-和BL2亞型之間的下游AKT信號通路不同，BL2亞型中GSK3B (S9/S21)、AKT1S1(T266)和FOXO3 (S294)的磷酸化水平較高(圖2c)。LAR和BL2腫瘤也表現出mTOR (S2478/ S2481)、EIF4EBP1 (S65)、EIF4B (S422)和RPS6KB1 (T421)的下游激活。然而，LAR亞型可能更依賴于蛋白翻譯，因為該亞型顯示最高的40S亞基磷酸化，RPS6 (S236)，表明PI3K和mTORC抑制劑可能都能有效靶向LAR腫瘤。從激活的MEK (pS222/S226)、ERK1 (T185/Y187)和ERK2 (T202/Y204)可以看出，BL2亞型中EGFR/MAPK信號通路表現出更高的活性(圖2d)。該亞型KRAS蛋白水平較高，RAF1活性較高(S29/S220)。EGFR信號可能參與了一些活躍的MAPK通路，磷酸化的EGFR (T693/ S1166)和適配器蛋白(SHC1和SOS1)證實了這一點。由于MAPK信號通路升高，BL2亞型可能對EGFR、MEK或ERK靶向治療敏感。M亞型的抗原加工和遞呈蛋白表達較低(圖2e)，包括免疫蛋白酶體(PSMB8/9)組分、抗原轉運(TAP1/2)和MHC-I抗原遞呈(HLA-A/B/C和B2M)。由于免疫激活的TNBC往往對化療有更好的反應，所以研究人員做出了假設，降低抗原呈提可能為該亞型提供免疫逃逸機制，而重新激活這一途徑可以提高標準化療的腫瘤療效。
由于M亞型的特點是缺乏免疫細胞和表觀遺傳修飾因子的LOF突變，研究人員通過評估TCGA TNBC腫瘤的整體DNA甲基化模式來檢查每個亞型的表觀遺傳格局。通過分析，確定了TNBC亞型之間差異甲基化的CpGs(圖a)。la亞型顯示了最多的差異高甲基化CpGs，而M亞型顯示了最多的低甲基化CpGs(圖b)。M亞型顯示的差異低甲基化CpGs(74288)大約是BL1-(37,011)、BL2-(23,033)或lar -亞型(30,020)的兩倍，并且均勻分布在整個染色體上(圖c)。DNA甲基化的整體差異主要發生在啟動子3kb的區域。具體來說，大多數lar亞型腫瘤的高甲基化區域發生在啟動子中，提示腫瘤分化程度更高(圖d)。使用啟動子區域(TSS 3kb)中差異甲基化的CpGs來鑒定每個TNBC亞型特有的一致基因表達(圖e)。盡管甲基化整體降低，但間質腫瘤在干擾素-γ(IFNG)、免疫檢查點基因(CD274、LAG3和TIGIT)和mhc介導的抗原處理呈遞(NLRC5、CIITA、HLA-A、HLA-B和TAP1)中表現出甲基化增加和表達降低。在M亞型腫瘤中，抗原提呈基因附近啟動子的甲基化顯示基因表達降低。通過對一致性甲基化/表達差異進行通路分析，以識別亞型特異性調控(圖f)。M亞型在包括免疫信號(干擾素-γ信號、ifn -γ反應、分化T淋巴細胞、TNF反應和免疫細胞因子信號)和抗原處理和呈遞的區域內高甲基化。此外，EZH2靶蛋白在高甲基化區域被抑制，表明該亞型中多梳抑制復合物2的調控解除(圖f)。為了更好地理解DNA甲基化變化對基因表達和染色質結構的影響，研究人員分析了遠端甲基化探針，這些探針與ELMER41鑒定的預測靶基因表達的ATAC-seq峰重疊。僅ATAC-seq能夠分離TNBC亞型。提供了染色質可及性可能導致亞型之間表達差異的證據。值得注意的是，M亞型顯示出更多的低甲基化區域，與染色質可及性和增強子區域的增加相對應。干擾素-γ可以上調MHC- i42的表達，而轉錄因子NLRC5和CIITA分別驅動MHC I類和II類的表達。這些發現表明了表觀遺傳學角度DNA甲基化是M亞型腫瘤抗腫瘤免疫功能的抑制機制。
圖1
圖2呃
由于間充質TNBC腫瘤表現出的整體表觀遺傳差異，于是接下來分析了來自Broad Cancer cell Line Encyclopedia (CCLE)的TNBC細胞系中表明PRC2活性的組蛋白H3 (H3K27me3)上賴氨酸27的DNA甲基化和三甲基化。與其他亞型相比，M亞型TNBC細胞模型顯示出最低的中位DNA甲基化(β值)和最高的中位H3K27me3水平(圖1a, b)。為了評估抗原提呈水平，研究人員使用泛MHC-I抗體(HLA-A/ b /C)分析蛋白表達。免疫印跡法顯示，M亞型TNBC細胞株的MHC-I總水平最低(圖2a)。然后在由固定細胞系組成的組織微陣列上進行免疫組化評估細胞MHC-I(圖2b)。與其他亞相比，M亞型細胞的MHC-I陽性細胞總數較低(圖1c)。此外，流式細胞術檢測細胞表面MHC-I的表達顯示，M亞型細胞株的MHC-I低表達，部分與未染色對照重疊(圖2c)。為了評估PRC2抑制對存活率/增殖的影響，將TNBC細胞用增加劑量的PRC2抑制劑處理，并在4天后相對于對照組測定其存活率。雖然非常低的劑量傾向于增加細胞數量，但TNBC細胞對PRC2抑制劑僅輕度敏感，即使在20μm時，也沒有任何化合物使存活率降低超過50%(圖2d)。為了識別PRC2復合體抑制的基因，研究人員用兩種不同的EZH2抑制劑或EED抑制劑mak683處理M亞型細胞系，然后評估5天后基因表達的變化(圖2e和圖1d)。研究人員在CAL51、CAL120和BT549細胞系中分別鑒定了1663、1463和2048個與所有抑制劑相同的差異轉錄本(圖2f)。絕大多數差異表達的轉錄本在PRC2抑制劑治療后表達增加。對每個細胞系(n = 275，結合)之間增加和共享的轉錄本的基因本體論分析是在與polycomb阻遏復合物2和H3K27me3相關的通路上，表明PRC2抑制基因的抑制降低(圖1e，f).許多額外升高的基因參與免疫信號、抗原呈遞、干擾素- γ和炎癥反應途徑(圖2f, g)。與MHC-I (NLRC5)或MHC-II (CIITA)轉激活因子表達增加相關(圖2h)。為了確定PRC2抑制后MHC-I蛋白水平是否發生變化，研究人員對CAL51、CAL120和BT549細胞株進行單劑量的tazemetostat、pi -1205或mark -683處理，并在1、3、5或7天評估蛋白表達。每一種化合物都能抑制PRC2活性，從H3K27me3在第3天到第7天的穩定下降可以證明(圖2i)。當H3K27me3蛋白水平降低時，MHC-I蛋白表達隨著PRC2的抑制而增加。每一種抑制劑的細胞表面MHC-I蛋白表達也增加了兩倍左右(圖2j)。MHC-I表達的增加是針對m亞型細胞的，因為PRC2抑制劑降低了H3K27me3而不改變其他TNBC亞型的MHC-I蛋白水平。因此，在用PRC2抑制劑處理的TNBC細胞中，MHC-I表達的增加有可能增加抗腫瘤免疫應答。
圖1
圖2
為了確定EZH2處理后HLA基因的重新表達是否與H3K27me3的去甲基化相對應，研究人員在DMSO或1 um EZH2抑制劑tazemetostat處理后4天對間充質TNBC細胞株進行H3K27me3染色質免疫沉淀測序(ChIP-Seq)(圖1a)。ChIP-seq分析顯示，經tazemetostat處理的BT549 (n = 221,518)、CAL120 (n = 54,339)和CAL51 (n = 58,967)細胞中H3K27me3全基因組沉積減少(圖2a)。此外，H3K27me3在EZH2 targets43和H3K27結合基因中降低。顯著下降的EZH2抑制峰在各細胞系間相似，至少2個細胞系共有約47%的峰，3個細胞系共有16%的峰(圖1b)。在H3K27me3、EED和SUZ12靶標中富集了三個細胞系共同的啟動子3 kb內的基因集富集分析(圖1c)。為了鑒定與H3K27me3降低相關的基因表達變化，研究人員檢測了與EZH2抑制降低的啟動子H3K27me3峰相關的RNA表達水平。研究人員注意到，在hox相關基因中出現了許多表達增加而啟動子H3K27me3減少的基因(圖2b)。眾所周知，PRC2可以沉默同源盒(HOX)基因位點，也可能有助于抑制MHC-I的表達。
此外，研究人員觀察到，在用他澤美司他處理的間充質細胞中，H3K27me3降低，MHC-I基因表達增加，NLRC5反轉錄(圖2b)。MHC-I基因座的基因組快照證實，在HLA-A (BT549)、HLA-B (BT549和CAL120)、HLA-C (CAL120和CAL51)的啟動子區域以及MHC-I反轉錄激活子NLRC5中幾個與增強子區域相對應的位置，H3K27me3降低(圖1d)。
圖1
圖2-4
為了確定PRC2抑制是否對M亞型有益，研究人員鑒定了一個免疫冷、間充質同系小鼠異種移植TNBC腫瘤模型。與人類細胞類似，PRC2抑制劑也能有效降低小鼠4T1細胞中的H3K27me3(圖1a)。4T1細胞表面MHC-I的表達水平也較低，可升高在小鼠中建立同基因的4T1異種移植物，并分別用兩周紫杉醇、每日兩次他美司他或聯合治療(圖1d)。治療與紫杉醇(平均382 mm3)或tazemetostat(平均433 mm3)單獨導致最后適度減少腫瘤體積相比vehicle-treated老鼠(平均643 mm3),而組合(平均237 mm3)明顯優于單獨每個代理(tazemetostat p = 0.015,紫杉醇p = 0.049)(圖1 e)。紫杉醇或他美司他單用并沒有降低最終腫瘤重量，然而，聯合用藥顯著降低了腫瘤重量與對照組小鼠相比，腫瘤大小減小(圖1f)。研究人員在切除的腫瘤上進行H3K27me3、Ki67和cleaved caspase-3的免疫組化染色。載體治療的腫瘤體積更大，腫瘤周圍有增殖的(Ki-67+)細胞，壞死核心有分裂的caspase-3陽性細胞(圖2)。H3K27me3表達的細胞局限于增殖的細胞，在tazemetostat治療的腫瘤中染色強度較低(圖3，4)。在紫杉醇或他美他汀治療的腫瘤壞死核心外存在cleaved caspase-3(圖2，4)。對CD3+ t細胞進行免疫組化，以確定治療是否改變腫瘤浸潤淋巴細胞。每次治療后，腫瘤內CD3+ t細胞均增加(紫杉醇1.68倍，他美司他1.85倍)，其中聯合治療(2.05倍)增加最大(圖1g)，可能導致腫瘤大小減小。
文章小結：
三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性強、進展迅速、生存率低、復發率高、預后較其他類型乳腺癌更差的乳腺腫瘤。隨著分子生物學技術的發展，醫學界逐步對TNBC開展了分子層面的深入研究。基于TNBC的異質性特征，越來越多的研究把重點放在了TNBC的分子亞型上。這篇文章在先前已經有了很多相關研究的基礎上，從突變，免疫的異質性入手，做了大量研究，很多思路都具有借鑒意義。
