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單細(xì)胞RNAseq揭示存在EGFR突變的早期肺腺癌中的腫瘤異質(zhì)性和免疫細(xì)胞群
今天解讀的這篇9+的文章也是刊登在《Oncogene》雜志上，該期刊是生化與分子生物學(xué)”子行業(yè)的優(yōu)秀級雜志，居于一線期刊。其收稿要求涵蓋了癌基因的結(jié)構(gòu)和功能的各個方面，尤其是: 細(xì)胞癌基因及其激活機(jī)制，其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，DNA和RNA的癌基因，腫瘤病毒，人類腫瘤的分子腫瘤學(xué)，腫瘤抑制基因，生長調(diào)控基因，細(xì)胞周期控制生長因子和受體細(xì)胞凋亡。中科院大類：醫(yī)學(xué)1區(qū) 中科院小類：生物與分子生物學(xué)。
為了更好的理解文章思路，仍首先以思維導(dǎo)圖的形式對文章進(jìn)行概括總結(jié)。
發(fā)現(xiàn)問題：
攜帶EGFR基因突變的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）在亞洲人群患者中較普遍存在，而目前仍未在單細(xì)胞分辨率上解決患者間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。
解決方法：
研究人員對來自7個攜帶EGFR突變的I/II期LUAD樣本和5個癌旁肺組織樣本的共計125,674個細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)。
結(jié)果解讀：
研究人員收集到的7例未經(jīng)治療的早期(I/II期)LUAD患者(LUAD 1-7)的腫瘤組織均攜帶最常見的EGFR激活突變，即L858R點突變和第19外顯子缺失(表1)。為進(jìn)行比較，還分析了分別與LUAD1-LUAD5匹配的5個腫瘤旁正常肺組織的細(xì)胞。從158,306個細(xì)胞中獲得了約43億個獨特的轉(zhuǎn)錄本，每個細(xì)胞檢測到1147個基因。經(jīng)過數(shù)據(jù)處理和標(biāo)準(zhǔn)化及數(shù)據(jù)過濾，獲得了125,674個細(xì)胞用于后續(xù)分析。
所有細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督的聚類后得到32個不同的簇(圖1b)，通過UMAP降維后進(jìn)行可視化。然后分析每個簇中經(jīng)典Markers的表達(dá)和差異表達(dá)基因（DEGs），并用熱圖形式展示出每個細(xì)胞類型中TOP5 DEGs，（篩選標(biāo)準(zhǔn)：p≤0.05, fold change≥1.5）(圖1c)，并將細(xì)胞分型：腫瘤細(xì)胞、支氣管/肺泡上皮細(xì)胞、髓系細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞(圖1b，c)。
scRNA-seq結(jié)果顯示：基質(zhì)細(xì)胞中占比最多的細(xì)胞類型為髓系細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，研究人員還采用免疫組織化學(xué)染色法（IHC）進(jìn)行蛋白水平的研究，結(jié)果與測序結(jié)果一致，也顯示腫瘤樣本中存在大量巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。
圖1. 對照組織和攜帶EGFR突變的LUAD樣本的scRNA-seq
研究人員接下來研究LUAD早期樣本中TAMs的特征。將髓樣細(xì)胞分為14個不同的亞群，發(fā)現(xiàn)大約90%的髓樣細(xì)胞是CD68+的巨噬細(xì)胞(圖2a，b)，而CD11B+(ITGAM)的巨噬細(xì)胞表達(dá)不高。與癌旁正常組織相比，TME中樹突狀細(xì)胞（DCs）增多，粒細(xì)胞減少(圖2a)，且與正常組織中的巨噬細(xì)胞相比，TAMs顯著高表達(dá)APOE和SPP1 (圖2c)，而該兩種蛋白被認(rèn)為能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲。TAMs的 DEGs進(jìn)行GO_BP富集分析，發(fā)現(xiàn)這些DEGs參與的生物學(xué)過程主要與細(xì)胞外基質(zhì)分解、對缺氧的反應(yīng)、膽固醇外流的正調(diào)節(jié)以及對TNF和IL1B的反應(yīng)有關(guān)(圖2d)，表明這些DEGs可能促進(jìn)細(xì)胞遷移、血管生成、腫瘤進(jìn)展和炎癥。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一個高表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因的TAM群體(圖2b中的集群8)，例如NUPR1，STMN1和MKI67，并用抗CD68和-Ki67抗體進(jìn)行IHC驗證這些增殖性巨噬細(xì)胞的存在(圖2e)。為了了解LUAD早期TAMs的極化，對所有CD68+的巨噬細(xì)胞進(jìn)行經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞(M1)和替代激活巨噬細(xì)胞(M2)特異性基因的檢測 (圖2f：紅色為M1型標(biāo)記基因；藍(lán)色為M2型標(biāo)記基因)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAMs和正常肺源性巨噬細(xì)胞都沒有表現(xiàn)出特異性的M1或M2特征，但它們具有相似的M1和M2特征基因的表達(dá)水平 (Pearson相關(guān)系數(shù)=0.16)，表明它們既具有極化特征，又處于M1和M2狀態(tài)之間的各種中間極化狀態(tài)(圖2g)。綜上所述，雖然早期LUAD中的TAMs似乎表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生的基因，但它們還沒有明顯的M1和M2極化。
研究人員發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞約占所有非惡性細(xì)胞群體的20-60%，但無偏聚類后并未發(fā)現(xiàn)在腫瘤樣本和正常組織樣本間存在不同的T細(xì)胞簇(圖3A)，故研究人員對每個簇的T細(xì)胞亞型進(jìn)行分析。分析了每個簇中T細(xì)胞亞型標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤T細(xì)胞高表達(dá)調(diào)節(jié)性和耗竭標(biāo)記，如TIGIT，LAYN，F(xiàn)OXP3和CTLA4，而正常組織中的T細(xì)胞高表達(dá)效應(yīng)性和初始T細(xì)胞標(biāo)志(圖3b, c)。此外研究人員還發(fā)現(xiàn)了一種增殖T細(xì)胞亞型(第7簇，高表達(dá)Ki67)，該亞型既表達(dá)效應(yīng)性T細(xì)胞特征(例如，GZMA)，也顯示了功能失調(diào)的標(biāo)記物，如LAG3、TIGIT和PD-1，表明腫瘤細(xì)胞毒活性受損(圖3d)。
TME中T細(xì)胞亞型的豐富程度與檢查點阻斷治療的預(yù)后密切相關(guān)，而TME中的DCs在介導(dǎo)T細(xì)胞趨化、分化和活化過程中發(fā)揮重要作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，LUAD中的DCs主要是具有抑制效應(yīng)性T細(xì)胞和促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的CD1C+的DC (圖3d，e)。綜上所述，研究結(jié)果提示，早期LUAD具有免疫抑制作用，T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性和耗竭性T細(xì)胞亞型，并伴有CD1C+DC的增多。
為了進(jìn)一步驗證對上述結(jié)果，研究人員使用癌旁組織中已被注釋的肺上皮細(xì)胞作為背景對照，從15,414個基因在潛在惡性細(xì)胞的每條染色體上的表達(dá)強(qiáng)度推斷出大規(guī)模的拷貝數(shù)變異(CNVs)。CNVs異常的細(xì)胞被鑒定為惡性細(xì)胞(圖4a)，根據(jù)DEGs的功能富集（GO_BP）分析，進(jìn)一步將其分為8個簇(圖4b)，對每個簇中的DEGs進(jìn)行KEGG_Pathway富集分析，結(jié)果顯示這些簇中的DEGs分別富集到缺氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻譯起始、細(xì)胞周期和抗原遞呈等途徑(圖4c)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)早期LUAD內(nèi)的腫瘤細(xì)胞中經(jīng)典的AT2細(xì)胞標(biāo)記物SFTPC或Clara細(xì)胞標(biāo)記物SCGB1A1除了在第3簇的細(xì)胞群體中高表達(dá)外，其余簇中均未高表達(dá)，但發(fā)現(xiàn)Clara細(xì)胞前體標(biāo)志物SCGB3A2和肺泡上皮祖細(xì)胞（AEP）標(biāo)志物TM4SF1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(圖4d，e)，即表示腫瘤細(xì)胞同時高表達(dá)近端和遠(yuǎn)端上皮祖細(xì)胞標(biāo)志物，腫瘤細(xì)胞由具有不同細(xì)胞系表達(dá)譜的性群體組成。
上述結(jié)果顯示了不同的腫瘤細(xì)胞群，其DEGs富集到了不同的Pathway上，表明它們之間進(jìn)展的異質(zhì)性。接下來，研究人員試圖用scRNA-seq獲得LUAD進(jìn)展過程中分化狀態(tài)的時間信息。
作者匯集了所有的惡性腫瘤細(xì)胞(圖1b)，并使用Monocle3R軟件包構(gòu)建了單細(xì)胞假時間軌跡。Monocle3對所有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行降維，并根據(jù)它們的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)對細(xì)胞進(jìn)行排序。作者在第3簇的細(xì)胞內(nèi)手動設(shè)置假時間軌跡的根狀態(tài)，因為它們?nèi)匀槐磉_(dá)正常的肺上皮標(biāo)記，如肺泡2型(AT2)細(xì)胞標(biāo)記SFTPC和Clara細(xì)胞標(biāo)記SCGB1A1，這表明它們?nèi)匀皇钦７紊掀ぜ?xì)胞的特征。然后，在計算每個單元的偽時間值之后獲得偽時間軌跡(圖5a)。利用Monocle3的圖形測試功能，作者確定了在時間軌跡內(nèi)在更高級的細(xì)胞中上調(diào)的基因。盡管它們位居榜首，但長的非編碼RNA(LncRNAs)MALAT1和NEAT1已經(jīng)被定性為肺癌和其他惡性腫瘤[36，轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。作者注意到，更多的改變基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白，如膜通道(例如APQ3)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如SLC34A2和NPC2)，這些蛋白可能與腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子偶聯(lián)。作者特別感興趣的是那些與癌癥進(jìn)展、TME信號和不良預(yù)后相關(guān)的基因，如LY6E、NAPSA、MUC1、ELF3和FOS (圖5b)。它們中的一些在肺癌中有很好的特征。例如，NAPSA是LUAD的常見預(yù)后標(biāo)志物。LY6E、MUC1和FOS在多種腫瘤的免疫逃逸和抑制性免疫微環(huán)境中起重要作用。在這項研究中，作者決定將重點放在ELF3的作用上，ELF3是一種調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，它與氣道炎癥有關(guān)，并在前列腺癌和結(jié)直腸癌中介導(dǎo)炎癥信號和腫瘤進(jìn)展。為了研究ELF3在LUAD中的作用，作者使用了TCGA LUAD數(shù)據(jù)(n=515)，發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比，ELF3在腫瘤樣本中上調(diào)(圖5c)。此外，TCGA數(shù)據(jù)集的基因集富集分析(GSEA)顯示，在ELF3表達(dá)水平較高的腫瘤中，CCND1和AKT上調(diào)的基因集過表達(dá)(圖5d)。綜上所述，這些結(jié)果提示ELF3在較晚期的LUAD細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并與LUAD中CCND1和AKT的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
ELF3可以調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌和化學(xué)誘導(dǎo)的肺損傷中的細(xì)胞周期和增殖。ELF3的高表達(dá)還通過激活絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB途徑促進(jìn)腫瘤生長。鑒于NF-κB通路在激活癌細(xì)胞存活基因和免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起重要作用，作者推測ELF3可能是LUAD中NF-κB通路的重要調(diào)節(jié)因子。作者首次證實，與正常肺組織相比，腫瘤組織中ELF3的蛋白水平上調(diào)(圖6a)。然后，作者用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-κ)檢測了ELF3和NF-ELFB靶基因在另外12例LUAD組織中的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)ELF3在所有腫瘤組織中的表達(dá)均高于匹配的正常組織。一些NF-κB靶基因如CCND1、BCL2L1和GADD45Band ICAM1在腫瘤組織中也表達(dá)上調(diào)(圖6b)。由于TME的其他細(xì)胞類型，特別是免疫細(xì)胞也高度表達(dá)NF-κB靶基因，作者決定使用LUAD細(xì)胞株A549和NCI-H1975來進(jìn)一步研究ELF3在腫瘤細(xì)胞中的功能。用siRNAs敲除ELF3后，NFKB1的表達(dá)沒有變化(圖6c)。BCL2L1、CCND1和PTGS2在兩種細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，而其他負(fù)責(zé)血管生成(即VEGFA)和轉(zhuǎn)移(即MMP9)的基因沒有變化(圖6c)。基因表達(dá)的降低至少部分是由于PI3K/AKT/NF-κB通路失活所致，因為PI3K、AKT、IKA和P65的磷酸化蛋白在ELF3基因敲除后都降低了(圖6d)。
已知免疫細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1B和腫瘤壞死因子ɑ可在不同細(xì)胞類型中激活NF-κB途徑。為了確定ELF3是否參與了LUAD細(xì)胞中NF-κB通路的激活，作者首先用IL1B處理A549和NCI-H1975細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)ELF3和與細(xì)胞存活和炎癥相關(guān)的NF-κB靶基因如BCL2L1、CCND1、PTGS2和ICAM1(圖6e)的表達(dá)上調(diào)，當(dāng)ELF3在兩個細(xì)胞系中被擊倒時(圖6f)，ELF3的表達(dá)受到抑制(圖6f)。應(yīng)該注意的是，根據(jù)宇宙細(xì)胞系項目數(shù)據(jù)庫，A549和NCI-H1975細(xì)胞沒有CCND1擴(kuò)增，CCND1擴(kuò)增出現(xiàn)在約3.64%的TCGA LUAD隊列中。作者推測了11號染色體上CCND1的一些拷貝數(shù)增加，除了ELF3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，可能還與其在某些腫瘤細(xì)胞中的過表達(dá)有關(guān)。綜上所述，腫瘤微環(huán)境中的促炎細(xì)胞因子IL1B可上調(diào)LUAD腫瘤細(xì)胞中ELF3的表達(dá)，從而增強(qiáng)NF-κB通路的激活，從而有利于腫瘤細(xì)胞的存活和生長。作者的結(jié)果提示，LUAD腫瘤細(xì)胞中的ELF3可能成為阻止腫瘤生長的一個新的治療靶點。
本文小結(jié)：
這項工作為了解亞洲患者中攜帶EGFR突變的早期LUAD的異質(zhì)性和免疫細(xì)胞譜提供了寶貴的資源。作者確定了包括ELF3在內(nèi)的關(guān)鍵基因，以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與其TME成分之間的相互作用，這表明ELF3可能成為LUAD中未來藥物發(fā)現(xiàn)的治療靶標(biāo)。
