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單細胞分析是目前的熱點方向，今天小編和大家分享一篇發表在Theranostics（IF:11.600）雜志上的關于尿路上皮癌（UC）的單細胞分析文章。文章利用單細胞數據，對UC進行分型。并對不同亞型的細胞組成及交互進行了分析，同時也探索了亞型特異微環境與預后及免疫應答的關聯。文章將經典的組織（bulk）數據分型思路應用到單細胞水平，這一思路值得小伙伴們參考學習。

Single-cell atlases link macrophages and CD8⁺ T-cell subpopulations to disease progression and immunotherapy response in urothelial carcinoma

單細胞圖譜解析巨噬細胞及CD8⁺ T細胞與尿路上皮癌的進展和免疫應答關聯

一．研究背景

尿路上皮癌(UC)是第四常見的腫瘤類型，包括侵襲性的上尿路上皮癌(UTUC)，以及在組織學上很常見的膀胱尿路上皮癌(UCB)。目前研究已經發現約60%的UTUC和15-20%的UCB都被診斷為肌肉浸潤型(MI)，具有較差的預后。此外，免疫檢查點抑制劑(ICIs)被發現對局部晚期或轉移性尿路上皮癌的治療具有重要意義，且與UCB相比UTUC對ICIs的應答率更高。因此，精確識別UC的不同亞型，對準確預測UC患者的ICI治療獲益具有重要的臨床意義。

二．文章摘要

該研究對12名UTUC患者的13個組織樣本進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析。并納入一個UCB (n = 404)隊列和一個UTUC (n = 158)隊列的組織RNA-seq測序數據，以及一個接受阿特珠單抗治療的轉移性尿路上皮癌(mUC)隊列(n = 348)對單細胞分析得到的關鍵結果進行分析和驗證。研究發現局部晚期UTUC中腫瘤浸潤的免疫細胞比例更高。此外，研究也在UTUC和UCB中識別了預后相關的基底細胞樣（basal）亞型和管腔樣（lumina）亞型。進一步研究也發現basal亞型中免疫抑制巨噬細胞和耗竭T細胞亞群富集，并表現出強相互作用。此外，研究也開發了一個捕獲免疫抑制巨噬細胞的基因表達特征(Macro-C3 score)來預測UC的預后及免疫治療應答。總之，該研究揭示了UC獨特的腫瘤微環境并揭示了新的免疫逃避的候選調節因子，為提高basal亞型的抗腫瘤免疫提供了潛在的治療靶點。

三．文章的主要內容及結果

1. UTUC的單細胞轉錄組景觀

在文章的第一部分，作者對UTUC的腫瘤內的異質性進行了刻畫。研究從12名UTUC患者中收集了12個原發腫瘤和一個配對的腫瘤血栓共13個組織樣本，用于scRNA-seq。研究還納入了一個UCB和一個UTUC的組織RNA-seq隊列，以及一組接受阿特珠單抗治療的(mUC)隊列作為驗證集(圖1A)。研究在對scRNA-seq數據進行質控后保留了67392個細胞，并將其聚類為22個細胞亞群(圖1B，C)。作者基于標記基因，將這些細胞亞群注釋為T細胞、髓系細胞、上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、肥大細胞、B細胞、漿細胞和自然殺傷細胞(NK)共九個細胞亞群。接下來作者在肌肉浸潤性(MI)腫瘤中觀察到免疫細胞的富集程度高于非肌肉浸潤性(NMI)腫瘤，而上皮細胞的比例則較低(圖1F)。此外，研究分析了一個UTUC隊列的組織RNA-seq數據，也觀察到與NMI腫瘤相比，MI腫瘤中免疫細胞亞群的比例顯著增加(圖1G)。

2. MI UTUC及MI UCB的lumina及basal亞型

在文章的第二部分，作者對惡性細胞的亞型進行了識別。作者首先通過inferCNV推斷細胞的染色體拷貝數變異(CNVs)，識別了31152個惡性細胞。接下來使用47個panel面板，根據表達譜，將MI UTUC樣本識別為lumina和basal亞型(圖2A)。此外，作者也發現這47個panel基因中的SPINK1基因在lumina型UTUC中表達上調，但在basal亞型中沒有。免疫組化也表明SPINK1的高表達，因此作者推測SPINK1可能是UTUC的潛在lumina亞型特異性生物標志物(圖2B)。作者使用這47個panel基因，也定義了兩個計算得分：basal得分和luminal得分，來量化這兩個亞型。在UTUC組織測序隊列中，作者發現basal評分與疾病特異性生存率(DSS)下降顯著相關，而單因素分析則發現luminal評分與DSS升高顯著相關(圖2C)。此外，使用TCGA數據也發現，basal評分和lumina評分能夠預測MI UCB的預后。為了進一步探索MI UTUC亞型的基因表達模式，作者在這兩種亞型的腫瘤細胞中識別出521個差異表達基因(DEGs)(圖2D, 2E)，并對這些基因進行GO富集分析，結果發現lumina亞型中上調的基因富集于與上皮細胞發育相關的通路。basal亞型中上調的基因則在免疫調節通路中富集(圖2F)。此外，研究也觀察到與lumina亞型相比，basal亞型中參與調節髓樣細胞分化的基因富集，且免疫逃避基因表達上調(圖2F和2G)。

3. 免疫抑制的巨噬細胞在basal亞型中富集且與較差的臨床結局相關

這一部分作者由于發現basal和lumina型腫瘤細胞在髓樣分化和遷移的調控方面存在差異(圖3A, 3B)，因此對UTUC中的髓系細胞進行分析。此外，由于巨噬細胞是髓系細胞中的一個主要細胞類型，因此重點分析巨噬細胞。研究在巨噬細胞中未觀察到傳統促炎(M1)和抗炎(M2)亞群的標記基因(圖3C)。進一步研究發現了一個巨噬細胞亞群(Macro-C3)在basal亞型中顯著富集(圖3D)。作者觀察到該亞群高表達與CD8⁺ T細胞招募相關的基因以及免疫檢查點和免疫逃逸基因(圖3B)，且與其他巨噬細胞相比，Macro-C3中免疫耐受誘導相關基因表達上調(圖3E)。在識別了一個亞型相關的巨噬細胞子集后，作者開發了一個主要由與免疫抑制相關的基因組成的Macro-C3特征(圖3F)，并將該特征應用到UTUC組織測序隊列，結果發現與scRNA-seq數據集一致，basal亞型的Macro-C3特征評分明顯高于NMI和luminal亞型(圖3G)。此外，作者也發現UTUC組織隊列中較高的Macro-C3特征評分與DSS和無進展生存期(PFS)降低顯著相關(圖3H)。

4. basal亞型中耗竭T細胞的擴張

接下來，作者對T細胞和NK細胞進行無監督聚類分析，結果識別了一個na?ve T細胞亞群、2個CD4⁺ T細胞亞群、3個CD8⁺ T細胞亞群和2個NK細胞亞群共8個亞群(圖4A-C)。這3個CD8⁺ T細胞亞群分別為：一個耗竭的CD8⁺ T細胞亞群（CD8- c1）(圖4B和4C)；一個高表達GZMK的細胞亞群（CD8- c2）；以及一個表達干擾素刺激基因的亞群（CD8- c3）(圖4B)。 CD4⁺ T細胞分別為一個調控(CD4- c1)以及一個耗竭CD4⁺ T細胞亞群(CD4- c2)(圖4B)。接下來為了確定T細胞的發育軌跡，作者進行了偽時間分析。結果觀察到CD4⁺ T細胞起源于na?ve T細胞，接著分化為CD4- c1及CD4- c2。而CD8⁺ T細胞的發育軌跡則是從na?ve狀態開始，經過CD8- c2，并以CD8- c1結束。接下來，研究也發現na?ve T細胞在basal亞型中的相對比例明顯低于其他兩種亞型(圖4D)，此外，耗竭的CD8⁺ T細胞群(CD8- c1)在basal亞型中顯著富集(圖4E)。TCGA-BLCA和UTUC組織隊列的單細胞去卷積分析也發現高比例耗竭CD8⁺ T細胞的與UCB和UTUC患者較差的生存顯著相關(圖4F)。

5. 髓系和淋巴組分的相互作用形成了basal UTUC的免疫抑制微環境

在這一部分作者研究了腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）有關的細胞間相互作用。研究發現巨噬細胞與上皮細胞的互作頻率高于其他髓系細胞，尤其是在basal亞型中(圖5A)，在這兩種細胞類型之間，研究也發現了強烈的由MIF和CD74介導的信號(圖5B)。此外，basal UTUC表現出較高的CD47-SIRPA和C3-C3AR1相互作用(圖5B)。因此，作者篩選了受體-配體對，發現CD8⁺ T細胞豐度、耗竭和巨噬細胞CXCL表達之間顯著正相關(圖5C)。此外，在basal 亞型中，作者發現由CXCL及其受體介導的巨噬細胞與CD8⁺ T細胞相互作用更強(圖5B)。這種關聯在TCGA-BLCA和另一個UTUC隊列中得到了進一步驗證，且多重免疫熒光染色也顯示，basal 亞型中表達CD68的巨噬細胞和表達CD8的CD8+ T細胞共定位(圖5D)。接下來，研究觀察到耗竭的CD8+ T細胞群CD8- c1與巨噬細胞表現出強烈的信號傳導(圖5E)，尤其是與Macro-C3(圖5F)。Macro-C3和CD8- c1的比例也一致正相關(圖5G)。通過分析UTUC組織測序隊列也進一步驗證了這種相關性，其中耗竭評分和Macro-C3特征評分也顯示出很強的相關性(圖5H)。總的來說，這些證據揭示了UTUC中髓系和淋巴細胞組分之間強烈的相互作用，并表明上皮細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞共同形成了basal亞型的免疫抑制微環境(圖5I)。

6. Macro-C3評分預測mUC的免疫治療應答

在文章的最后一部分，作者探索了亞型特異性免疫表型是否可以預測治療反應。因此對一個阿特珠單抗治療的轉移性尿路上皮癌(mUC)的隊列進行了分析。研究將患者腫瘤分為NMI亞型、lumina和basal亞型。在mUC數據集中，觀察到basal腫瘤(38%)比lumina腫瘤(20%)或NMI(11%)腫瘤比例更高，且表現出炎癥表型(圖6A)。免疫組化染色進一步證實了basal亞型的炎癥表型(圖6B)。進一步分析發現PD-L1在免疫細胞上的表達與basal亞型無關(圖6C)。接下來，作者發現了CD274-PDCD1, CD86-CTLA4和LGALS9-HAVCR2等多種已知的相互作用與T細胞耗竭的正相關(圖6D)。此外，作者也發現免疫抑制的Macro-C3特征基因和T細胞毒性基因的表達隨著basal特征增強而增加(圖6E)。因此，作者開發了一種計算方法，使用Macro-C3評分建模免疫逃逸程度，使用T細胞毒性評分建模細胞毒性T細胞(圖6F)。結果發現Macro-C3評分與PD-L1阻斷治療應答者比例顯著相關。因此，作者將Macro-C3標記定義為ICI響應評分(圖6G)。為了評估ICI反應的預測性能，作者將ICI反應評分與Macro-C3評分以及預測免疫檢查點抑制的臨床反應的已發表特征(TIDE)評分進行了比較。結果ROC曲線展示ICI反應評分的性能優于TIDE評分(圖6H)。

到這里這篇文章的主要內容就介紹完了。研究使用單細胞數據，對UC進行了分型，并對不同亞型的腫瘤微環境組分及互作等進行了分析，并研究了與臨床結局及免疫應答的關聯。文章內容豐富，但是分析方法并不難，是一篇具有參考意義的單細胞分型分析文章，感興趣的小伙伴不要錯過呀。