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單細(xì)胞分析是目前的熱點(diǎn)方向，今天小編和大家分享一篇發(fā)表在Theranostics（IF:11.600）雜志上的關(guān)于尿路上皮癌（UC）的單細(xì)胞分析文章。文章利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)，對UC進(jìn)行分型。并對不同亞型的細(xì)胞組成及交互進(jìn)行了分析，同時(shí)也探索了亞型特異微環(huán)境與預(yù)后及免疫應(yīng)答的關(guān)聯(lián)。文章將經(jīng)典的組織（bulk）數(shù)據(jù)分型思路應(yīng)用到單細(xì)胞水平，這一思路值得小伙伴們參考學(xué)習(xí)。
Single-cell atlases link macrophages and CD8+ T-cell subpopulations to disease progression and immunotherapy response in urothelial carcinoma
單細(xì)胞圖譜解析巨噬細(xì)胞及CD8+ T細(xì)胞與尿路上皮癌的進(jìn)展和免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)
一．研究背景
尿路上皮癌(UC)是第四常見的腫瘤類型，包括侵襲性的上尿路上皮癌(UTUC)，以及在組織學(xué)上很常見的膀胱尿路上皮癌(UCB)。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約60%的UTUC和15-20%的UCB都被診斷為肌肉浸潤型(MI)，具有較差的預(yù)后。此外，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)被發(fā)現(xiàn)對局部晚期或轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌的治療具有重要意義，且與UCB相比UTUC對ICIs的應(yīng)答率更高。因此，精確識別UC的不同亞型，對準(zhǔn)確預(yù)測UC患者的ICI治療獲益具有重要的臨床意義。
二．文章摘要
該研究對12名UTUC患者的13個(gè)組織樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)分析。并納入一個(gè)UCB (n = 404)隊(duì)列和一個(gè)UTUC (n = 158)隊(duì)列的組織RNA-seq測序數(shù)據(jù)，以及一個(gè)接受阿特珠單抗治療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌(mUC)隊(duì)列(n = 348)對單細(xì)胞分析得到的關(guān)鍵結(jié)果進(jìn)行分析和驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)局部晚期UTUC中腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞比例更高。此外，研究也在UTUC和UCB中識別了預(yù)后相關(guān)的基底細(xì)胞樣（basal）亞型和管腔樣（lumina）亞型。進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)basal亞型中免疫抑制巨噬細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞亞群富集，并表現(xiàn)出強(qiáng)相互作用。此外，研究也開發(fā)了一個(gè)捕獲免疫抑制巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)特征(Macro-C3 score)來預(yù)測UC的預(yù)后及免疫治療應(yīng)答。總之，該研究揭示了UC獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境并揭示了新的免疫逃避的候選調(diào)節(jié)因子，為提高basal亞型的抗腫瘤免疫提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
三．文章的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. UTUC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀
在文章的第一部分，作者對UTUC的腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性進(jìn)行了刻畫。研究從12名UTUC患者中收集了12個(gè)原發(fā)腫瘤和一個(gè)配對的腫瘤血栓共13個(gè)組織樣本，用于scRNA-seq。研究還納入了一個(gè)UCB和一個(gè)UTUC的組織RNA-seq隊(duì)列，以及一組接受阿特珠單抗治療的(mUC)隊(duì)列作為驗(yàn)證集(圖1A)。研究在對scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后保留了67392個(gè)細(xì)胞，并將其聚類為22個(gè)細(xì)胞亞群(圖1B，C)。作者基于標(biāo)記基因，將這些細(xì)胞亞群注釋為T細(xì)胞、髓系細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)共九個(gè)細(xì)胞亞群。接下來作者在肌肉浸潤性(MI)腫瘤中觀察到免疫細(xì)胞的富集程度高于非肌肉浸潤性(NMI)腫瘤，而上皮細(xì)胞的比例則較低(圖1F)。此外，研究分析了一個(gè)UTUC隊(duì)列的組織RNA-seq數(shù)據(jù)，也觀察到與NMI腫瘤相比，MI腫瘤中免疫細(xì)胞亞群的比例顯著增加(圖1G)。
2. MI UTUC及MI UCB的lumina及basal亞型
在文章的第二部分，作者對惡性細(xì)胞的亞型進(jìn)行了識別。作者首先通過inferCNV推斷細(xì)胞的染色體拷貝數(shù)變異(CNVs)，識別了31152個(gè)惡性細(xì)胞。接下來使用47個(gè)panel面板，根據(jù)表達(dá)譜，將MI UTUC樣本識別為lumina和basal亞型(圖2A)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)這47個(gè)panel基因中的SPINK1基因在lumina型UTUC中表達(dá)上調(diào)，但在basal亞型中沒有。免疫組化也表明SPINK1的高表達(dá)，因此作者推測SPINK1可能是UTUC的潛在lumina亞型特異性生物標(biāo)志物(圖2B)。作者使用這47個(gè)panel基因，也定義了兩個(gè)計(jì)算得分：basal得分和luminal得分，來量化這兩個(gè)亞型。在UTUC組織測序隊(duì)列中，作者發(fā)現(xiàn)basal評分與疾病特異性生存率(DSS)下降顯著相關(guān)，而單因素分析則發(fā)現(xiàn)luminal評分與DSS升高顯著相關(guān)(圖2C)。此外，使用TCGA數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)，basal評分和lumina評分能夠預(yù)測MI UCB的預(yù)后。為了進(jìn)一步探索MI UTUC亞型的基因表達(dá)模式，作者在這兩種亞型的腫瘤細(xì)胞中識別出521個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)(圖2D, 2E)，并對這些基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lumina亞型中上調(diào)的基因富集于與上皮細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的通路。basal亞型中上調(diào)的基因則在免疫調(diào)節(jié)通路中富集(圖2F)。此外，研究也觀察到與lumina亞型相比，basal亞型中參與調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞分化的基因富集，且免疫逃避基因表達(dá)上調(diào)(圖2F和2G)。
3. 免疫抑制的巨噬細(xì)胞在basal亞型中富集且與較差的臨床結(jié)局相關(guān)
這一部分作者由于發(fā)現(xiàn)basal和lumina型腫瘤細(xì)胞在髓樣分化和遷移的調(diào)控方面存在差異(圖3A, 3B)，因此對UTUC中的髓系細(xì)胞進(jìn)行分析。此外，由于巨噬細(xì)胞是髓系細(xì)胞中的一個(gè)主要細(xì)胞類型，因此重點(diǎn)分析巨噬細(xì)胞。研究在巨噬細(xì)胞中未觀察到傳統(tǒng)促炎(M1)和抗炎(M2)亞群的標(biāo)記基因(圖3C)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)巨噬細(xì)胞亞群(Macro-C3)在basal亞型中顯著富集(圖3D)。作者觀察到該亞群高表達(dá)與CD8+ T細(xì)胞招募相關(guān)的基因以及免疫檢查點(diǎn)和免疫逃逸基因(圖3B)，且與其他巨噬細(xì)胞相比，Macro-C3中免疫耐受誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)(圖3E)。在識別了一個(gè)亞型相關(guān)的巨噬細(xì)胞子集后，作者開發(fā)了一個(gè)主要由與免疫抑制相關(guān)的基因組成的Macro-C3特征(圖3F)，并將該特征應(yīng)用到UTUC組織測序隊(duì)列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與scRNA-seq數(shù)據(jù)集一致，basal亞型的Macro-C3特征評分明顯高于NMI和luminal亞型(圖3G)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)UTUC組織隊(duì)列中較高的Macro-C3特征評分與DSS和無進(jìn)展生存期(PFS)降低顯著相關(guān)(圖3H)。
4. basal亞型中耗竭T細(xì)胞的擴(kuò)張
接下來，作者對T細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，結(jié)果識別了一個(gè)na?ve T細(xì)胞亞群、2個(gè)CD4+ T細(xì)胞亞群、3個(gè)CD8+ T細(xì)胞亞群和2個(gè)NK細(xì)胞亞群共8個(gè)亞群(圖4A-C)。這3個(gè)CD8+ T細(xì)胞亞群分別為：一個(gè)耗竭的CD8+ T細(xì)胞亞群（CD8- c1）(圖4B和4C)；一個(gè)高表達(dá)GZMK的細(xì)胞亞群（CD8- c2）；以及一個(gè)表達(dá)干擾素刺激基因的亞群（CD8- c3）(圖4B)。 CD4+ T細(xì)胞分別為一個(gè)調(diào)控(CD4- c1)以及一個(gè)耗竭CD4+ T細(xì)胞亞群(CD4- c2)(圖4B)。接下來為了確定T細(xì)胞的發(fā)育軌跡，作者進(jìn)行了偽時(shí)間分析。結(jié)果觀察到CD4+ T細(xì)胞起源于na?ve T細(xì)胞，接著分化為CD4- c1及CD4- c2。而CD8+ T細(xì)胞的發(fā)育軌跡則是從na?ve狀態(tài)開始，經(jīng)過CD8- c2，并以CD8- c1結(jié)束。接下來，研究也發(fā)現(xiàn)na?ve T細(xì)胞在basal亞型中的相對比例明顯低于其他兩種亞型(圖4D)，此外，耗竭的CD8+ T細(xì)胞群(CD8- c1)在basal亞型中顯著富集(圖4E)。TCGA-BLCA和UTUC組織隊(duì)列的單細(xì)胞去卷積分析也發(fā)現(xiàn)高比例耗竭CD8+ T細(xì)胞的與UCB和UTUC患者較差的生存顯著相關(guān)(圖4F)。
5. 髓系和淋巴組分的相互作用形成了basal UTUC的免疫抑制微環(huán)境
在這一部分作者研究了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）有關(guān)的細(xì)胞間相互作用。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞的互作頻率高于其他髓系細(xì)胞，尤其是在basal亞型中(圖5A)，在這兩種細(xì)胞類型之間，研究也發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的由MIF和CD74介導(dǎo)的信號(圖5B)。此外，basal UTUC表現(xiàn)出較高的CD47-SIRPA和C3-C3AR1相互作用(圖5B)。因此，作者篩選了受體-配體對，發(fā)現(xiàn)CD8+ T細(xì)胞豐度、耗竭和巨噬細(xì)胞CXCL表達(dá)之間顯著正相關(guān)(圖5C)。此外，在basal 亞型中，作者發(fā)現(xiàn)由CXCL及其受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞相互作用更強(qiáng)(圖5B)。這種關(guān)聯(lián)在TCGA-BLCA和另一個(gè)UTUC隊(duì)列中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，且多重免疫熒光染色也顯示，basal 亞型中表達(dá)CD68的巨噬細(xì)胞和表達(dá)CD8的CD8+ T細(xì)胞共定位(圖5D)。接下來，研究觀察到耗竭的CD8+ T細(xì)胞群CD8- c1與巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的信號傳導(dǎo)(圖5E)，尤其是與Macro-C3(圖5F)。Macro-C3和CD8- c1的比例也一致正相關(guān)(圖5G)。通過分析UTUC組織測序隊(duì)列也進(jìn)一步驗(yàn)證了這種相關(guān)性，其中耗竭評分和Macro-C3特征評分也顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性(圖5H)。總的來說，這些證據(jù)揭示了UTUC中髓系和淋巴細(xì)胞組分之間強(qiáng)烈的相互作用，并表明上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞共同形成了basal亞型的免疫抑制微環(huán)境(圖5I)。
6. Macro-C3評分預(yù)測mUC的免疫治療應(yīng)答
在文章的最后一部分，作者探索了亞型特異性免疫表型是否可以預(yù)測治療反應(yīng)。因此對一個(gè)阿特珠單抗治療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌(mUC)的隊(duì)列進(jìn)行了分析。研究將患者腫瘤分為NMI亞型、lumina和basal亞型。在mUC數(shù)據(jù)集中，觀察到basal腫瘤(38%)比lumina腫瘤(20%)或NMI(11%)腫瘤比例更高，且表現(xiàn)出炎癥表型(圖6A)。免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)了basal亞型的炎癥表型(圖6B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PD-L1在免疫細(xì)胞上的表達(dá)與basal亞型無關(guān)(圖6C)。接下來，作者發(fā)現(xiàn)了CD274-PDCD1, CD86-CTLA4和LGALS9-HAVCR2等多種已知的相互作用與T細(xì)胞耗竭的正相關(guān)(圖6D)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)免疫抑制的Macro-C3特征基因和T細(xì)胞毒性基因的表達(dá)隨著basal特征增強(qiáng)而增加(圖6E)。因此，作者開發(fā)了一種計(jì)算方法，使用Macro-C3評分建模免疫逃逸程度，使用T細(xì)胞毒性評分建模細(xì)胞毒性T細(xì)胞(圖6F)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Macro-C3評分與PD-L1阻斷治療應(yīng)答者比例顯著相關(guān)。因此，作者將Macro-C3標(biāo)記定義為ICI響應(yīng)評分(圖6G)。為了評估ICI反應(yīng)的預(yù)測性能，作者將ICI反應(yīng)評分與Macro-C3評分以及預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制的臨床反應(yīng)的已發(fā)表特征(TIDE)評分進(jìn)行了比較。結(jié)果ROC曲線展示ICI反應(yīng)評分的性能優(yōu)于TIDE評分(圖6H)。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。研究使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)，對UC進(jìn)行了分型，并對不同亞型的腫瘤微環(huán)境組分及互作等進(jìn)行了分析，并研究了與臨床結(jié)局及免疫應(yīng)答的關(guān)聯(lián)。文章內(nèi)容豐富，但是分析方法并不難，是一篇具有參考意義的單細(xì)胞分型分析文章，感興趣的小伙伴不要錯(cuò)過呀。
