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小編總結(jié)：
單細胞分析是最近的研究熱點，其基礎(chǔ)分析的思路要經(jīng)歷以下幾步：
1.細胞鑒定（在這里我把質(zhì)控省去了，因為文獻一般會把這步放入補充材料中），單細胞數(shù)據(jù)分析的第一步是分亞群，亞群分好之后最重要的一步（也是最難的一步）就是對亞群進行細胞類型注釋。一般結(jié)合細胞類型Marker基因、細胞類型注釋軟件和文獻數(shù)據(jù)做比對的方法綜合進行注釋，從而獲取樣本中真正的細胞類型組成。
2.對于單細胞多樣本差異分析。主要分為兩大類：差異表達和差異豐度，前者檢測相同類型細胞在不同條件下表達的變化，后者檢測不同條件下細胞類型組成的變化。通過樣本間比較發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群或比例差異顯著的亞群。
3.發(fā)育分化等多時間點的設(shè)計可以獲取隨著時間和分化進程細胞類型或基因的動態(tài)變化。通過多樣本差異比較可以幫助挖掘與疾病、發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵細胞亞群或基因，篩選疾病標志物，是單細胞數(shù)據(jù)分析必做的一步。
4.上下游富集分析。GSEA富集分析可以預(yù)測不同細胞類型預(yù)先定義的基因集的基因分布趨勢，從而判斷其對表型的影響。GSVA富集分析主要評估不同的代謝通路在不同細胞類型或樣品間是否富集。Pathway分析：基于分子研究上下游通路關(guān)系。
文章簡介：
這篇文章1發(fā)表在Nature Communications雜志上，在最近一年的影響因子: 14.919比上一年增加2.798。這篇文章無論是思路還是作圖都非常全面解讀單細胞類文章的基礎(chǔ)思路。
背景知識：
鼻咽癌(NPC)的腫瘤微環(huán)境(TME)是一個異質(zhì)的、動態(tài)的間質(zhì)群體。全面了解這一腫瘤特異性生態(tài)系統(tǒng)對于提高癌癥診斷、治療和預(yù)后是必要的。作者報告了TME中具有高度代表性的特征，包括表型豐度、遺傳變化、免疫動力學(xué)、克隆擴張、發(fā)育軌跡和分子相互作用，這些特征深刻地影響著患者的預(yù)后和治療結(jié)果。
結(jié)果解讀：
本研究共入選14例患者，其中11例被診斷為鼻咽癌，另外的被診斷為鼻咽淋巴增生(NLH)。通過使用唯一分子識別符(UMI)對每個單個細胞進行編碼，然后進行計數(shù)分析(Fig.1a)。作者獲得了66,627個細胞，其中50,169個細胞(75%)來自NPC微環(huán)境，16,458個細胞(25%)來自非惡性微環(huán)境，平均每個細胞檢測到1215個中位基因和99739個中位讀數(shù)(Fig.1b)。然后作者使用UMAP方法進行降維處理，實現(xiàn)了細胞分布的可視化。在此基礎(chǔ)上，作者通過公認的標記基因?qū)⑦@些簇劃分為六個主要的細胞譜系(Fig.1b, c)。盡管髓系細胞和成纖維細胞在TME中表現(xiàn)出強烈的偏好，但大多數(shù)簇既不是腫瘤特異性的，也不是患者特異性的，這表明主要基質(zhì)譜系的組成沒有廣泛的差異(Fig.1b, e)。再用免疫組織化學(xué)組化鑒定患者的間質(zhì)浸潤程度(Fig.1f)。鼻咽癌微環(huán)境中T細胞和B細胞是最主要的細胞類型(Fig.1d)。
從32,656個T細胞中產(chǎn)生了14個亞群，代表了鼻咽癌微環(huán)境中最普遍和最多樣化的細胞類型(Fig.2a)。用標記基因來鑒定和表征腫瘤浸潤性T細胞亞群(Fig.2d)。例如，用LAG3、HAVCR2和TOX鑒定和表征了三個不同的耗竭T細胞亞群，這三個亞群以前在T細胞功能障礙中被報道過。雖然大多數(shù)T細胞亞群在患者間表現(xiàn)出輕微的異質(zhì)性，但相對豐度和激活/抑制特征有很大不同(Fig.2c, d)。在鼻咽癌微環(huán)境中觀察到兩個耗竭T細胞亞群，其特征是高表達免疫檢查點分子HAVCR2和耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TOX (Fig.2c)。其他T細胞亞型，包括調(diào)節(jié)性T細胞和活化T細胞，也優(yōu)先在TME中浸潤，而幼稚T細胞和中央記憶性T細胞更可能存在于非惡性微環(huán)境中。通過Deconvolution分析，證實了作者的發(fā)現(xiàn)。鼻咽癌患者的效應(yīng)T細胞亞型、耗竭T細胞亞型和抑制性T細胞亞型高度富集(Fig.2c)。作者通過CD3、CD8、FOXP3和PD-1的多色免疫熒光進一步驗證了耗竭T細胞亞型和Treg細胞的富集，顯示出與作者的單細胞數(shù)據(jù)一致的結(jié)果(Fig.2e)。這提示T細胞功能紊亂和免疫抑制在很大程度上影響了T細胞對鼻咽癌的免疫功能。因此，作者后來比較了鼻咽癌和非惡性微環(huán)境來源的T細胞的標志性通路。通路分析顯示，鼻咽癌來源的T細胞中干擾素-γ(IFN-γ)和干擾素-α(IFN-α)反應(yīng)途徑上調(diào)，提示慢性激活導(dǎo)致的1型和2型干擾素(IFN)的過表達可能顯著影響浸潤的T細胞的組成和功能狀態(tài)(Fig.2f)。來自非惡性微環(huán)境的T細胞主要受NF-κB途徑的影響(Fig.2f)。總體而言，鼻咽癌來源的T細胞與NLH(鼻咽淋巴增生)來源的T細胞相比，表現(xiàn)出明顯的功能差異。進一步證實鼻咽癌組織中T細胞浸潤與非惡性微環(huán)境之間的存在分子差異。
作者進行了MAST分析以確定T細胞中的差異表達基因(Deg)(Fig.3a)。其中，作者通過RegNetwork預(yù)測了前30個上調(diào)基因的上游轉(zhuǎn)錄因子，并通過Cytoscape構(gòu)建了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Fig.3b)。作者發(fā)現(xiàn)CXCL13和LGALS1在鼻咽癌來源的T細胞中顯著上調(diào)的。CXCL13是濾泡輔助性T細胞的基因標志之一。但在耗竭T細胞中，特別是PD-1+T細胞上也有高表達(Fig.3c)。因此，作者根據(jù)CXCL13基因表達的中位數(shù)將鼻咽癌患者分為CXCL13高表達組和CXCL13低表達組。在CXCL13高表達組，作者觀察到CXCR5+B細胞比例顯著高于CXCL13低表達組(Fig.3e)。此外，CXCL13的高表達與鼻咽癌患者更好的生存相關(guān)，這表明CXCL13高表達的耗竭T細胞可能仍然有利于免疫調(diào)節(jié)(Fig.3f)。據(jù)報道，LGALS1在多種免疫細胞中具有免疫調(diào)節(jié)功能，本研究發(fā)現(xiàn)LGALS1在鼻咽癌相關(guān)Tregs中高表達(Fig.3d)。作者還發(fā)現(xiàn)，在LGALS1高的患者中，免疫抑制Tregs的比例明顯高于靜息Tregs，這表明LGALS1可能在Treg激活中起重要作用(Fig.3e)。盡管LGALS1可能成為恢復(fù)Treg免疫抑制功能的一個有前途的治療靶點，但LGALS1缺陷如何影響Treg活性的分子機制仍很不清楚。基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)S100A11和S100A4在LGALS1+Treg中上調(diào)，作者預(yù)測與LGALS1相互作用的可能通路，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控作用可能是通過鈣通道依賴的過程來實現(xiàn)的(Fig.3b)。
下游分析揭示了一組豐富的功能模塊，這些模塊與T細胞亞群中的幼稚、細胞毒性、耗竭和免疫調(diào)節(jié)類有關(guān)。因此，作者確定這些T細胞亞群中最具代表性的基因，包括CCR7(幼稚)、NKG7(細胞毒性)、LAG3(耗竭)和FOXP3(Treg)。作者后來構(gòu)建了包含與代表性基因最相關(guān)的前十個基因的基因圖譜(Fig.3g–j)。作者首先對CD8+T細胞簇內(nèi)的細胞毒活性方案進行了定量比較。結(jié)果表明，耗竭T細胞群(C5、C6和C7)保持了中到高的細胞毒活性，這提示在TME中可能存在一個過渡過程，由于慢性激活和腫瘤依賴機制，效應(yīng)性T細胞逐漸失去細胞毒性(Fig.3g)。此外，對耗竭程序的分析表明，耗竭狀態(tài)不僅在耗竭T細胞中產(chǎn)生，而且在效應(yīng)T細胞中也可以被誘導(dǎo)，但程度較低，說明激活-耗竭的轉(zhuǎn)變確實是一個動態(tài)過程(Fig.3h)。對所有T細胞進行的幼稚程序的定量分析表明，CD4+和CD8+幼稚T細胞具有較高的幼稚分數(shù)(Fig.3i)。對Treg程序的分析表明，抑制性Treg比靜息Treg具有更強的免疫調(diào)節(jié)能力(Fig.3j)。這可能是抑制性Tregs中分子編碼基因的高表達導(dǎo)致的，其中包括CD27、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFRSF18和ICOS。為了驗證線性模型的可靠性，作者進行了功能評分并進行T細胞亞群之間豐度的相關(guān)性分析。結(jié)果表明，功能評分與T細胞豐度高度相關(guān)，提示線性模型可以全面、準確地估計鼻咽癌微環(huán)境中T細胞動態(tài)功能狀態(tài)(Fig.4a)。此外，作者分析了Chen等人研究的一個獨立的單細胞隊列中的T細胞亞群。結(jié)果表明作者的模型在Chen的數(shù)據(jù)中計算的功能分數(shù)與T細胞亞群的豐度高度相關(guān)，這進一步證明了作者線性模型的可靠性(Fig.4b)。功能評分與相應(yīng)基因顯著相關(guān)，表明與基于簽名的表征方法相比，線性模型能夠更全面、更準確地從批量RNA測序數(shù)據(jù)中量化真實的動態(tài)T細胞功能狀態(tài)(Fig.4c)。
為了研究浸潤的T細胞在鼻咽癌和非惡性微環(huán)境中的克隆性多樣性，作者系統(tǒng)地分析了單個T細胞上TCR。總體而言，每個患者檢測到2071個獨特的克隆類型。克隆類型在所有患者中是高度不同的，但在NPC和NLH患者中克隆大小的組成相對保持一致。因此，作者根據(jù)分配給每個克隆的細胞數(shù)量將克隆類型分為三類(Fig.5a)(克隆大小≥3,=2和=1)。根據(jù)克隆細胞數(shù)量，表明T細胞在顳下頜關(guān)節(jié)周圍有很強的克隆性增殖(Fig.5b)。相比之下，T細胞在非惡性微環(huán)境中的擴張相對靜止，因為它主要由具有小克隆的T細胞主導(dǎo)(Fig.5b)。作者后來計算了4-13名患者的耗竭和Treg評分，發(fā)現(xiàn)這兩個評分都與較大(克隆大小≥為3和=2)克隆性呈正相關(guān)。這一結(jié)果表明，鼻咽癌患者TME中耗竭T細胞和Tregs經(jīng)歷了快速的克隆性增殖，并最終導(dǎo)致了這些T細胞亞型的高豐度(Fig.5c)。
為了進一步了解克隆擴增及其對T細胞動力學(xué)的影響，每個患者中最大的三個克隆及其相應(yīng)的克隆類型用UMAP進行可視化(Fig.5d)。如圖所示，不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的C5-LAG3、C6-HAVCR2和C7-TOX耗竭T細胞表現(xiàn)出不同的細胞毒性和耗竭活性。發(fā)育軌跡提供了一種獨特的可視化方法，可以推斷鼻咽癌和非惡性微環(huán)境中T細胞的譜系結(jié)構(gòu)。CD8+T細胞的運動軌跡顯示，HAVCR2耗竭、TOX耗竭、LAG3耗竭和TRM分別位于不同分支的末端，表明了它們不同的發(fā)育過程(Fig.5e)。軌道上的CD4+T細胞也表現(xiàn)出從幼稚T細胞向Tregs、中央記憶T細胞和T濾泡輔助細胞的過渡過程(Fig.5f)。假時間估計表明靜息Tregs是一個發(fā)育較早的亞型，這進一步支持了作者先前的發(fā)現(xiàn)，即抑制性Tregs作為一種更成熟的形式，具有更強的免疫調(diào)節(jié)能力，并經(jīng)歷了更強勁的克隆擴張。
B細胞以前被認為是TME中相對均一的種群。作者在11個不同的亞型中檢測到27,506個B細胞(Fig.6a, b)。在患者2、6和7中，血漿B細胞被特異性地富集，這導(dǎo)致了在患者間鼻咽癌微環(huán)境中的B細胞出現(xiàn)了異質(zhì)性 (Fig.6c)。雖然血漿B細胞和記憶B細胞的數(shù)量在TME中顯著增加，但由于患者間存在較大差異，這一數(shù)字并未達到統(tǒng)計學(xué)意義(Fig.6c)。在非惡性微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)總幼稚B細胞和ILB細胞富集，而NPC中尤其富含IFN誘導(dǎo)的B細胞(包括幼稚B細胞)和雙陰性B細胞(Fig.6d)。Deconvolution分析證實血漿B細胞和雙陰性B細胞更有可能滲透到鼻咽癌微環(huán)境中。而PAN B細胞，包括幼稚B細胞、未活化B細胞和先天B細胞，在非惡性微環(huán)境中優(yōu)先富集(Fig.6e)。與T細胞亞群的結(jié)果一致，B細胞的通路分析表明，鼻咽癌來源的B細胞也受到干擾素-γ和干擾素-α釋放的影響，而NLH來源的B細胞則因炎癥紊亂而改變(Fig.6f)。為了進一步了解B細胞浸潤的功能，作者進行了克隆分析，以量化每個患者中克隆類型的分布和多樣性(Fig.6g)。總體而言。與T細胞結(jié)果相似，鼻咽癌患者中較大的B細胞克隆顯著豐富，而NLH患者中較小的克隆更為豐富(Fig.6h)。
將3671個髓樣細胞分成11個亞群，作者發(fā)現(xiàn)95%的髓樣細胞來源于鼻咽癌患者，表明髓樣細胞的聚集是一個NPC依賴的過程(Fig.7a, b)。作者的單細胞數(shù)據(jù)顯示存在三個主要的髓系成分，包括髓系抑制細胞(MDSCs)、巨噬細胞和樹突狀細胞(DCs) (Fig.7c)。并將這些細胞進行更細致的分類 (Fig.7a, d)。與T細胞和B細胞亞群相比，髓系細胞，特別是TAMs，由于患者間的差異和組織特異性，表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性(Fig.7e)。例如，來自患者6(C1、C2和C3)和患者8(C4)的TAMs表現(xiàn)出高度不同的遺傳特征(Fig.7c)。此外，Deconvolution分析顯示，鼻咽癌患者的MDSC高度富集(Fig.6f)。NPC來源的和NLH來源的髓樣細胞的通路富集證實，IFNs的也參與塑造了NPC患者的髓樣結(jié)構(gòu)(Fig.7g)。
成纖維細胞和NK細胞所表示兩種次要亞群在NPC微環(huán)境。NPC患者中的成纖維細胞大量富集（圖1d,e）。MAST分析揭示了在成纖維細胞和NK細胞中不同的基因表達譜。編碼細胞外基質(zhì)（ECM）成分（例如COL1A1，COL1A2，LUM和FN1）的基因特異性表達是由成纖維細胞表達的，這表明，鼻咽癌微環(huán)境中的ECM非常復(fù)雜，可能通過整合素信號與周圍的腫瘤和基質(zhì)細胞相互作用。抑制腫瘤和免疫細胞上的特定整合素受體可能作為一個潛在的治療靶標。類似于效應(yīng)T細胞，NK細胞通常表達高水平的細胞毒性基因，包括NKG7，GZMA，GZMB和GZMH。NK細胞在慢性激活后KIR、NKG2A、LAG3和HAVCR2的上調(diào)，但作者沒有觀察到NK細胞中這些衰竭標志物的上調(diào)情況。
基于作者的單細胞測序數(shù)據(jù)，作者利用標注簽名矩陣對88例鼻咽癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)進行Deconvolution，通過CIBERSORTx估計免疫豐度(Fig.8a)。每個患者的功能評分也被計算并歸一化，隨后被用來表征T細胞的動態(tài)狀態(tài)(Fig.8b)。隨后，作者評估了每個免疫亞型和患者群的風(fēng)險比。結(jié)果表明，耗竭T細胞表現(xiàn)出較好的無進展存活率，而其他T細胞亞型與存活率沒有明顯的相關(guān)性(Fig.8c)。
為了描述來自NPC微環(huán)境和NLH微環(huán)境的細胞間的分子相互作用異，作者應(yīng)用CellPhoneDB在38個已鑒定的亞群中構(gòu)建了一個細胞-細胞通訊網(wǎng)絡(luò)。由于T細胞和B細胞在微環(huán)境中高度浸潤，作者主要觀察了T和B亞群內(nèi)的細胞通訊(Fig.9a)。作者發(fā)現(xiàn)，與抑制性Tregs相比，靜息Tregs與耗竭 T細胞的相互作用恨少，這表明它們是一種動力較弱、免疫抑制程度較低的亞型(Fig.9b)。與上述發(fā)現(xiàn)一致的是，TME中的HAVCR2和TOX耗竭T細胞主要通過CXCL13-CXCR5軸與不同的B細胞亞群表現(xiàn)出很強的相互作用(Fig.9c)。值得注意的是，與非惡性T細胞相比，NPC來源的耗竭T細胞和抑制性Tregs擁有更多的配體-受體對，而靜息Tregs、雙陰性B細胞和組織駐留的T細胞擁有更少的配體-受體對(Fig.9d)。
參考文獻
1. Gong L, Kwong DL, Dai W, et al. Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun 2021; 12(1): 1540.
