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今天分享的文章“基于MVI相關基因的肝細胞腫瘤預后模型的鑒定和驗證 Identification and Validation of a Prognostic Model Based on Three MVI-Related Genes in Hepatocellular Carcinoma”，這篇文章于2022年發表（Int J Biol Sci , IF 10.75)。
微血管浸潤( MVI)是指顯微鏡下鑒定的tumor侵犯血管，與tumor血道轉移密切相關，是HCC肝內或遠處轉移，術后復發和不良預后的獨立危險因素。目前仍沒MVI相關分子標志物指導肝細胞癌診斷和治療。作者探索了新的MVI(微血管侵犯)相關生物標志物，并建立了預測HCC預后的風險評分模型，可以為HCC患者個性化治療提供基礎。
一、背景
肝細胞癌是世界上最常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病隱匿，易復發和轉移，由于缺乏有效的預測和治療策略，預后往往較差，即使經過治愈性治療，許多HCC患者仍會在5年內出現腫瘤復發。因此，迫切需要開發新的預后評估方法來預測患者的臨床預后。
微血管浸潤(MVI)是指顯微鏡下可見血管腔內內皮細胞排列的腫瘤細胞團。腫瘤細胞可存在于肝門靜脈或肝靜脈，是肝內或遠處轉移的潛在因素，并可促使術后復發，MVI是一個獨立的組織病理學預后因素，與HCC患者在所有階段的生存相關，還是術后早期復發和生存的關鍵因素和重要指標。近年來，雖然MVI在肝癌治療選擇和預后評估中的臨床價值越來越受到重視，但由于MVI的診斷主要基于術后病理檢查，目前仍沒有推薦的MVI相關分子標志物來預測HCC的預后，限制了MVI在指導肝癌診斷和治療中的應用。
在本研究中，作者探索了新的MVI相關生物標志物，并建立了預測HCC預后的風險評分模型，旨在為HCC患者提供合適的治療方案。術前準確預測MVI，有利于醫生在做出更合理的、個性化的手術范圍選擇術后隨訪策略制定，實現基于腫瘤生物學行為的個體化治療，有望改善患者的預后。
二、方法
1.數據采集和預處理
收集了兩組HCC RNA-seq數據。HCC的全基因組mRNA表達和臨床病理信息作為訓練隊列從（TCGA LIHC下載）。共收集了95例MVI癌組織，210例無MVI癌組織和58例與臨床數據相匹配的正常組織。于國際癌癥基因組協會（ICGC LIRI-JP）下載驗證隊列。
2.TCGA隊列中差異表達MVI相關基因的鑒定
有或沒有MVI的癌組織分別用于與正常組織的差異分析。將DEG（具有MVI的癌組織與正常組織）中的差異基因作為MVI相關的差異表達基因。
3.Go和KEGG分析
將153個MVI相關基因應用于GO和KEGG途徑富集分析。
4.HCC的預后signature開發和評估
基于訓練集構建預后signature，然后在驗證集中驗證其預測性能。首先進行單變量Cox比例風險回歸分析確定了預后相關基因，以評估訓練集中MVI相關基因與OS之間的相關性。利用最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）懲罰Cox比例風險回歸來減少模型的基因并限制解決過擬合問題的復雜性。逐步Cox回歸分析用于確定用于構建風險模型以預測HCC患者的預后。將中位風險評分設置為臨界值，將患者分為高風險組和低風險組。Kaplan–Meier生存曲線用于低危組和高危組之間的生存比較。此外，建立了時間依賴性受試者工作曲線（包括1年，3年和5年生存率）來反映signature的敏感性和特異性。
5.signature的臨床特征
應用Wilcoxon檢驗分析風險評分與臨床特征（年齡，性別，階段，等級和分化等級）的關聯，并且使用相同的方法將signature應用于具有不同臨床特征的患者亞組，以區分低風險和高風險病例。
6.識別構造signature的獨立預后作用
使用Cox回歸模型方法進行了多變量分析，以驗證其獨立于后價值。對具有不同臨床特征（包括年齡，性別和分期）的患者的生存率進行亞組分析，以進一步評估特征的預后表現。
7.預后基因signature中基因的外部驗證
基于驗證組，構建Kaplan-Meier曲線來驗證基因signature的預測價值，多變量Cox分析評估基因signature在驗證組中的獨立預后作用。
三、結果
1.MVI陽性和MVI陰性HCC組織中的差異表達基因
比較MVI和非MVI組中上調和下調的DEG（與非tumor組織相比），得到差異表達 MVI相關基因(MVIRGs)，用于后續建模。
MVIRGs的功能分析：主要參與血管內皮的生長和微管的聚集，并且主要參與代謝相關途徑、tumor轉錄障礙和DNA復制途徑。（圖1）
2.預后模型的構建和識別
單因素Cox篩選出與與預后相關的MVIRG，基于這些MVIRG進行LOSSO和Cox回歸，構建基于MVI的預后模型，最后選擇三個關鍵的MVIRG（DBF4、ARG2和SLC16A3）構建模型（圖2）。
3.三種MVIRGs的表達與HCC患者臨床參數之間的相關性。
為了進一步驗證該模型，作者分析了三種MVIRGs的表達與HCC患者臨床參數之間的相關性。KM曲線顯示，DBF4和SLC16A3基因的高表達與HCC患者的低OS顯著相關,DBF4高表達、SLC16A3高表達與HCC的tumor分級存在顯著相關性(圖3)。
4.分析模型計算的風險評分與臨床數據之間的相關性
高風險評分與腫瘤分級、分期、T分期顯著相關；多元Cox顯示風險評分和分期是OS的獨立危險因素（圖4）。
5.使用附加數據隊列(ICGC)確認預后模型
將ICGC隊列中的HCC患者分為低或高風險組，KM分析顯示兩組之間存在顯著差異；多因素Cox分析還顯示，風險評分和分期是HCC患者預后的獨立危險因素，驗證了預測模型具有良好的預測價值（圖5）。
6.臨床組織樣本的驗證
HCC組織和成對的相鄰組織相比，顯示與3個MVIRGs（DBF4、ARG2和SLC16A3）相對應的特征蛋白在腫瘤組織中染色更強烈，陽性區域更多（免疫組化）；HCC樣本中三種MVIRGs（DBF4、ARG2和SLC16A3）的表達高于相鄰組織（qRT-PCR）；隨訪數據進行分析，MVIRGs高表達者RFS和OS更低（圖6）。
7.列線圖模型的構建與識別
將常規臨床參數引入并構建列線圖模型，c-index為0.697，校準曲線驗證了該模型具有良好的預測值（圖7）。
四、討論
MVI是HCC患者生存的重要預測因子，基于此，作者將MVI相關基因與常規臨床參數相結合，構建了一個預后模型。富集分析表明，這些MVIRGs主要富集血管內皮的生長和微管的積累，主要通過代謝途徑，腫瘤轉錄紊亂途徑和DNA復制途徑影響HCC的預后。這些結果與以前的研究結果一致。例如，MVI意味著在內皮細胞排列的血管腔中可見腫瘤細胞簇，這表明它與血管內皮的生長和微管的積累有關。此外，MVI與上皮-間質轉化（EMT）密切相關，EMT涉及多種機制，包括代謝變化，轉錄調控和表觀遺傳異常，表明MVI也與這些途徑有關。
用于建模的三個關鍵的MVIRGs（DBF4，ARG2和SLC16A3）與腫瘤密切相關，其中DBF4編碼的蛋白質具有模塊化結構，在DNA復制、復制檢查點激活、減數分裂、有絲分裂退出、跨病變合成和組蛋白穩態中起著關鍵作用。過去的一些研究曾指出，較高的ASK/Dbf4表達黑色素瘤與較低的無復發生存率相關，抑制Cdc7/Dbf4激酶活性會影響癌細胞中MCM2上的特異性磷酸化位點。ARG2（精氨酸酶2）是一種蛋白質編碼基因，其活性的增加通常與更晚期的疾病和不良的臨床預后有關，此外與腫瘤免疫反應密切相關。最近的研究發現，ARG2的過度表達是多種癌癥類型的預后不良因素，包括胰腺癌、甲狀腺腫瘤、胃癌、神經母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和急性髓系白血病（AML）。其他的一些研究發現，ARG2的缺失可導致氨的積累和肥胖相關胰腺癌生長的抑制，線粒體ARG2是CD8+T細胞功能和抗腫瘤功效的細胞自主調節因子。有趣的是，一些學者發現ARG2還具有抑癌作用。它可以通過生物合成輔因子磷酸吡哆醛的消耗和多胺毒性的增加來抑制腎癌的進展。
SLC16A3（溶質載體家族16成員3）是蛋白質編碼基因。由SLC16A3基因編碼的單羧酸轉運蛋白4（MCT4）可以催化單羧酸的質子連接轉運，單羧酸參與體內許多代謝過程，并產生抗凋亡作用。MCT4在糖酵解組織中顯著存在，如缺氧癌細胞，在某些癌細胞中過表達，并在癌細胞生長和增殖中起關鍵作用。已有的研究表明，SLC16A3是肺腺癌患者預后不良和轉移的獨立指標，是胰腺癌代謝過程的關鍵調節因子，SLC16A3對腫瘤診斷和預后具有良好的預測能力，并且參與甲狀腺癌和透明細胞腎細胞癌中SLC16A3啟動子DNA甲基化和/或MCT4蛋白水平的表觀遺傳調控機制。
綜上，這三個關鍵的MVIRGs（DBF4，ARG2和SLC16A3）與腫瘤及其預后密切相關，這也在一定程度上證明了選擇這三個MVIRGs建立預后模型的正確性。
