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早晨好呀，小編與您一起開啟元氣滿滿的一天！腸道菌群與腫瘤治療的相關研究蒸蒸日上，而腸道菌群是如何調控腫瘤微環境中免疫細胞異質性而影響藥物應答呢？近期《Cell》雜志上發表一篇名為“Microbiota triggers STING-type I IFN-dependent monocyte reprogramming of the tumor microenvironment”的文章，該研究思路邏輯清晰，環環相扣，巧妙的地挖掘臨床數據驗證基礎研究結論，讓我們一起來抽絲剝繭，揭曉答案！
腸道菌群觸發腫瘤微環境中STING-IFN-Ⅰ依賴的單核細胞重編程
背景：
腸道菌群可影響抗腫瘤免疫功能，控制腫瘤細胞自發生長以及調控化學治療和免疫治療的應答效應。免疫細胞在腫瘤微環境（TME）中扮演關鍵角色，其浸潤類別和比例對臨床治療效果有重要預測價值。單核吞噬細胞系統（MPs）作為TME的重要組成部分，存在高度的異質性和可塑性，包括單核細胞 [Mo]、巨噬細胞 [Macs] 和樹突狀細胞 [DCs]，Mo可分化為DCs誘導抗腫瘤反應，也可分化為Macs促進腫瘤的免疫抑制和疾病進展。腸道菌群組成與個體對免疫檢查點阻斷（ICB）的反應之間存在關聯，但菌群能否調節TME中MPs的異質性以及涉及的信號傳導路徑有待研究。
本文的研究者發現缺乏微生物群會使TME向促腫瘤性Macs傾斜。微生物群衍生的STING（stimulator of interferon genes）激動劑可誘導瘤內單核細胞產生I型干擾素（IFN-I），從而調節巨噬細胞極化和NK-DC軸。采用高纖維飲食調節腸道菌群可觸發瘤內IFN-I-NK-DC信號軸，并提高免疫檢查點阻斷（ICB）的療效，表明化療藥物反應者（R）與非反應者（NR）之間的免疫細胞構成差異可通過糞便菌移植轉移來實現。這項研究揭示了微生物群和TME之間的調控新機制，有望改善癌癥治療預后。
結果：
1，菌群缺失誘導腫瘤微環境中Macs增加，而Mo和DCs減少
為探究菌群是否參與塑造TME中MPs構成，首先將EL4淋巴瘤腫瘤植入SPF小鼠和無菌飼養GF小鼠，通過NanoString分析，基因組富集分析（GSEA）結合免疫學基因組（ImmGen）數據，發現在SPF鼠和GF鼠的腫瘤浸潤性MPs之間存在顯著分布差異（圖1A-B）。對腫瘤組織進行單細胞RNA測序（scRNA-seq），證實SPF鼠的TME中以DCs為主，而GF鼠更傾向分化為促腫瘤性Macs細胞（圖1C-H）。GSEA結果顯示IFN-α應答是Macs和DCs細胞的最主要途徑。SPF的MPs與抗腫瘤有關，而GF的MPs與免疫調節和抗炎功能有關（圖1I-J）。菌群缺乏會導致腫瘤內IFN-Ⅰ信號傳導受損，MPs更傾向于Macs浸潤，而Mo和DCs比例減少。
2，菌群調控腫瘤IFN-I-NK細胞軸
在TME中，GF鼠的Mo和DCs的數量顯著低于SPF，使用廣譜抗生素（ABX）抑制SPF鼠的菌群會出現類似的表型（圖2A-B）。缺乏菌群的小鼠存在TME特異性而非全身性DCs生成障礙（圖2C-D）。說明在菌群缺失的情況下，Mo和DCs的數量均減少（圖2E-G）。因此，盡管以菌群為導向的信號在生理水平不足以控制自發腫瘤生長，但對于調控MPs構成和獲得良好的抗腫瘤治療應答至關重要。
為了解菌群如何調控TME中的MPs，對可能影響MPs功能的瘤內細胞因子和趨化因子進行檢測。發現在GF鼠的EL4腫瘤中，與Mo和DCs的募集、維持和功能相關的蛋白質以及IFN-I在蛋白質（IFNa）和mRNA（Ifnb1）均降低（圖3A-B）。推測菌群可以調節TME中IFN-I的產生，利于抗腫瘤免疫應答。為明確在缺乏菌群的情況下，缺乏IFN-I信號而導致的相同TME重塑是否影響治療應答，采用化療藥物奧沙利鉑（oxa，需要菌群信號和髓樣細胞發揮療效）作用于Ifnar1-/-鼠，發現Ifnar1-/-鼠顯示出對oxa的反應類似于ABX或GF鼠（圖3D），證實IFN-I信號是oxa應答所必需。STING是IFN-I產生的一個主要調節因子，在化療過程中發揮重要作用。STING的缺乏（Tmem173-/-）則引起oxa的應答受損，與Ifnar1或菌群信號的缺失相似（圖3E）。說明菌群對抗腫瘤治療效果的影響至少部分是通過IFN-I誘導產生的。
蛋白質數據分析顯示，GF鼠和Ifnar1-/-腫瘤中對NK細胞募集和激活至關重要的IFN誘導蛋白數量和NK細胞比例顯著降低，GF鼠腫瘤中Xcl1表達降低（圖3F-I）。比較來自SPF與GF鼠腫瘤的NK細胞的轉錄譜，發現SPF的NK細胞具有活化表型，編碼效應蛋白和已知調節NK細胞功能的基因表達較高。相反，來自GF的NK細胞表達更高水平的轉化生長因子β誘導蛋白（Tgfbi）基因，IFNg也顯著減少（圖3J）。結果顯示：菌群誘導TME中的IFN-I信號引起NK細胞的有效募集和激活，NK細胞通過募集DC觸發正反饋路徑以促進抗腫瘤免疫應答。
3，STING激動劑c-di-AMP刺激腫瘤IFN-I-NK軸并重編程MPs
STING介導的IFN-I信號可以增強NK細胞的抗腫瘤作用。推斷菌群衍生的STING激動劑，如環狀二核苷酸（CDNs）將能夠調節TME中的IFN-I-NK-DC軸。采用細菌CDN環狀二腺苷單磷酸酯（c-di-AMP [cdAMP]）體外刺激腫瘤浸潤細胞，發現cdAMP誘導下的TME細胞是IFN-I的主要來源（圖3K）。cdAMP誘導IFN-I產生引起Xcl1和Ccl5的增加表達（圖3L）。有趣的是，對SPF或GF鼠腫瘤中MPs的NanoString分析顯示GF腫瘤的Mo產生Ifnb1的能力受損（圖3M），可解釋IFN-I蛋白的減少、NK細胞的功能障礙。為挽救GF鼠TME的IFN-I信號缺陷，模擬菌群衍生物的潛在系統性效應，發現GF動物在cdAMP作用下，腫瘤內的IFN-I基因水平增加并恢復Mo和DCs的浸潤（圖3N-O）。結果表明：菌群衍生產物，如STING激動劑cdAMP通過IFN-I調節TME中先天免疫細胞的相互作用和抗腫瘤應答反應。
4，高纖維飲食可調節菌群，誘導IFN-I，增加DCs，改善抗腫瘤應答
腸道菌群組成與癌癥治療效應有關。SPF小鼠在EL4腫瘤植入前喂飼高纖維飲食（FD）或ABX來調控小鼠腸道菌。發現與對照飲食的小鼠相比，FD小鼠的EL4腫瘤的發生率和總DCs的絕對數量增加，且出現較低的癌癥風險和自發腫瘤生長抑制狀態（圖4A-C）。MC38模型證實FD可重塑腫瘤內MPs構成，增加DCs和Mo，減少Macs（圖4D-H）。更重要的是FD顯著增強抗PD-1和抗PD-L1治療的療效（圖4I-J）。結果：調控菌群可以改變TME的構成，特別是DCs比例，進而調控抗腫瘤應答能力。
5，Akkermansia muciniphila可觸發TME中IFN-I-NK-DC軸
為探索IFN-I-NK細胞軸在FD誘導TME重塑中的作用，將FD飼養的小鼠糞便移植（FMT）到GF動物體內。發現FD移植后的GF鼠腫瘤中IFN-I基因水平更高，表達Ifnb1的Mo比例更高，NK細胞的Xcl1表達增加（圖5A）。證實FD小鼠菌群通過IFN-I重塑TME，調節DCs含量增加和抗腫瘤應答能力。
為評估由FD引起的菌群的變化，對不同地區繁育小鼠進行FD飼喂后進行糞便16S rRNA測序，發現FD飼喂足以誘導類似的腸道菌群組成（圖5B）。而菌群中α-多樣性減少，phyla Verrucomicrobia與Proteobacteria豐度增加，Firmicutes減少（圖5C）。然后構建transkingdom網絡預測，網絡由13個細菌節點和4個表型節點組成。Akkermansia與cDC浸潤呈正相關，與腫瘤負荷呈負相關，表明Akkermansia與腫瘤控制有關（圖5D）。
為探索單一類型微生物是否足以誘發TME中的免疫變化，利用雙位數的間性中心（BiBC）分析衡量網絡中單個節點影響，發現Akkermansia具有最高的BiBC得分（圖5E），成為介導FD調節的DCs和腫瘤生長表型的最佳候選菌。為測試Akkermansia的預測調節作用，在腫瘤植入前，將Akkermansia muciniphila (Akk) 單克隆鼠與GF小鼠相比，發現DCs明顯增加，pro/antitumor中Macs比率明顯降低，抑制腫瘤生長（圖5F-G）。
為驗證Akk利于重塑TME是通過STING-IFN-I路徑實現。采用液相色譜-質譜法（LC-MS）測量細菌產生的CDNs（cdAMP，c-di-guanosine monophosphate [cdGMP]和c-GAMP），發現Akk以產生cdAMP為主（圖5H）。分析來自SPF、GF或GF+Akk的小鼠腸道內容物，發現SPF小鼠可產生三種CDNs，GF小鼠中未檢測到，而Akk可誘導GF小鼠生成cdAMP（圖5I），證實Akk在體內主要誘導生成cdAMP。
為檢測cdAMP的生物活性及其誘導IFN-I的潛力，將熱滅活Akk或其培養上清與STING-IRF3細胞在有或無STING抑制劑的情況下共同培養，兩者均可誘導STING介導的IRF3激活（圖5J）。然后探索Akk是否也能調節體內IFN-I-NK細胞軸，發現GF+Akk的TME中產生Ifnb1的Mo和NK細胞的Xcl1表達增加（圖5K）。證實Akk的存在與TME中IFN-I-NK-DC軸的激活促進抗腫瘤應答之間的直接聯系。
6，瘤內Mo-IFN-I-NK-DC相互作用與黑色素瘤患者對ICB的反應相關
菌群如何影響癌癥患者對ICB藥物的應答？為探究這個問題，通過重新分析經ICB治療黑色素瘤患者隊列的RNA-seq數據[1]，發現IFN-I基因與Mo、NK細胞和DCs之間存在顯著的正相關關系（圖6A）。在缺乏菌群的小鼠和無應答者（NR）腫瘤中，抑制腫瘤的MPs細胞類型和細胞因子/趨化因子的基因特征明顯降低（圖6B）。此外，重分析在接受ICB治療的黑色素瘤患者的驗證隊列中觀察到類似的結論[2]，即Mo、IFN-I、趨化因子、DCs、CDC1和IL15RA基因高表達與治療后總體生存率的提高顯著相關，而趨化因子產生與NK細胞功能有關（圖6C-D）。在ICB應答者（R）和NR的TME中觀察到的治療效果差異，支持菌群通過重編程TME先天免疫細胞影響個體對ICB的應答反應。
7，菌群調控IFN-I和TME中的MPs細胞構成，以促進ICB治療作用
為了驗證在R和NR個體的TME免疫成分差異與菌群之間調控關系，對來自ICB治療的3個R和個NR個體進行FMT，即糞便分別移植給GF鼠（圖7A）。接受R-FMT的GF鼠TME中的Mo獲得刺激性表型，與SPF相似。相反，接受NR-FMT的GF鼠的MPs向Macs傾斜（圖7B-C），類似于GF。NR-FMT小鼠的腫瘤內DCs和Mo也顯著減少，促進/抗腫瘤Macs比率增加，NK細胞有減少趨勢（圖7D）。此外，NR-FMT腫瘤降低Ifnb1表達并導致NR-FMT小鼠的腫瘤生長抑制性差（圖7E-F）。證明菌群、腫瘤內IFN-I和ICB反應之間存在因果調控關系。
最后從臨床角度驗證調控關系，利用一項I期臨床試驗中，患有抗PD-1難治性轉移性黑色素瘤患者接受FMT后獲得有效應答再次接受抗PD-1治療，對治療有效人群（trial-R）和無效人群（trial-NR）腫瘤的RNA-seq數據[3]重分析，發現IFN-α應答是FMT后上調的首要途徑之一（圖7G）。此外，Mo、IFN-I、NK細胞、趨化因子、DCs、cDC1s、IL-15/IL-15RA和CD8 T細胞的基因特征在FMT后的trial-R組中均出現升高（圖7H）。相對于基線水平（FMT前），以上基因特征在FMT后試驗trial-R組腫瘤中有所增加，但在trial-NR組中保持不變（圖7I）。說明菌群、瘤內IFN-I-NK-DC軸，以及癌癥患者對ICB的反應之間存在明顯的因果調控關系。
通過對以上內容的學習，主要結論歸納為以下幾點：
1，菌群產生的STING激動劑（cdAMP）誘導TME中Mo產生IFN-I，觸發抗腫瘤作用。
2，Mo調節NK細胞的招募和激活以及隨后的NK與DCs間的調控關系。
3，破壞菌群導致Mo/IFN-I/NK/DC信號傳導異常，Mo分化為促腫瘤Macs。
4，FD可調節菌群產生cdAMP，觸發IFN-I途徑并改善抗腫瘤應答反應。
5，移植來自ICB 應答個體的菌群可誘導腫瘤內IFN-I，重塑TME，利于ICB應答。
參考文獻：
[1] Helmink, B.A., S.M. Reddy, J. Gao, et al. B cells and tertiary lymphoid structures promote immunotherapy response[J]. Nature, 2020, 577(7791): 549-555.
[2] Liu, D.,B. Schilling. Integrative molecular and clinical modeling of clinical outcomes to PD1 blockade in patients with metastatic melanoma[J], 2019, 25(12): 1916-1927.
[3] Baruch, E.N.,I. Youngster. Fecal microbiota transplant promotes response in immunotherapy-refractory melanoma patients[J], 2021, 371(6529): 602-609.
