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小編今天給大家解讀一篇最近發表在Journal of Thoracic Oncology雜志（IF: 20.121）上的文章,題目是“Single cell analysis reveals transcriptomic features of drug tolerant persisters and stromal adaptation in a patient-derived EGFR-mutated lung adenocarcinoma xenograft model”。
靶向治療需要終生治療，因為停藥會導致腫瘤復發。復發主要是由在細胞毒性藥物作用下存活的少數耐藥持久性（DTP）細胞亞群驅動的。在肺癌方面，DTP的研究主要是通過細胞系模型進行的。作者使用一種由表皮生長因子受體(EGFR)突變驅動的肺腺癌(LUAD)患者來源的異種移植瘤(PDX)進行了體內DTP研究。每天用EGFR抑制劑erlotinib治療荷瘤小鼠5-6周后，腫瘤明顯縮小，并產生DTP，通過全外顯子組、批量群體轉錄組和單細胞RNA測序(scRNA-seq)進行分析。DTP可能起源于特定的預先存在的癌細胞亞群，其激活了特定的耐藥途徑。TKI治療誘導DTP表現出這些通路的更強激活，同時將主要的先前存在的CAF群體轉換到一種新的狀態，這可能進一步促進DTP的生存。
厄洛替尼縮小PHLC137 PDX腫瘤，治療1個月后進入最小殘留病(MRD)狀態(圖1A)。由于證實MRD含有尚未發展到獲得性耐藥的DTP，當TKI治療停止時，腫瘤會重新出現，并對藥物產生反應。基礎治療和厄洛替尼治療的DTP腫瘤顯示粘液分化，表明DTP沒有去分化。DTP腫瘤還表現出間質纖維化增加(圖1B)，類似于新輔助EGFR TKI治療后EGFR突變的肺癌，并顯示Ki67表達降低(圖1C,D)。
DTP和未經治療的（BL）腫瘤在外顯子突變、拷貝數改變或亞克隆結構(圖2A,B)方面沒有差異。因此，在厄洛替尼治療后，沒有出現遺傳上不同的耐藥亞克隆。識別了DTP中相對于BL的1051個DEG。(圖2C)。使用Hallmark基因集的GSEA發現，下調的DTP DEGs在細胞周期、E2F和MYC活性方面富集，與DTP Ki67表達降低一致。上調的DTP DEGs在NF-кB通路激活方面富集最多(圖2D)。上調最多的DTP基因是APOE(圖2C)。APOE在腦和肺損傷期間上調，以防止由EGFR TKIs觸發的氧化損傷。MUC5AC也與其他幾種黏蛋白一起上調，支持DTPs維持或增加粘液譜系分化。此外，幾種乙醇脫氫酶(ALDHs)有較高水平表達，這可能有助于DTPs耐受TKI產生的活性氧。為了確定DEG是否轉化為可以標記DTP狀態的蛋白質表達差異，對兩個上調的DTP基因ECM1和AKAP12進行了IHC。這兩種蛋白在DTP腫瘤細胞中的表達高于在BL腫瘤細胞中的表達(圖2E和F)。
scRNA-seq分析了約3000個高質量的BL癌細胞，但從顯微鏡下的DTP腫瘤中只獲得了94個高質量的細胞，這與它們的MRD性質一致。結合BL和DTP數據顯示了7個簇(圖3A,B)。簇6包括77%的DTP和4%的BL細胞。由于該聚類包含了大部分的DTPs，將簇6中的122個BL細胞標記為DTPL。在偽時序分析中，腫瘤細胞沿三部分軌跡分布(圖3C)。所有DTPs都只出現在單一狀態的末端，表明處于穩定狀態。大多數DTPs和DTPL細胞在同一狀態的末端緊密聚集在一起，而一些DTPL細胞位于骨干路徑上，提示存在過渡狀態。DTP或DTPL細胞的偽時序值最高，BL細胞的偽時序值最低，說明從BL到DTPL再到DTP的過渡過程。該分析支持DTPL細胞不僅與DTPs相似，而且可能是DTPs的前體(圖3C)。
在簇6內，99%的DTP和97%的DTPL細胞處于G1，而其他簇中，95%的DTP和48%的BL細胞處于G1(圖3D)。因此，DTPL細胞共享DTPs減少的周期分布。為了進一步研究DTPs和DTPL細胞之間的相似性，從scRNA-seq數據中鑒定了相對于BL細胞的DEG。對于DTPL細胞，相對于簇6之外的BL細胞，鑒定出524個DEGs; 70%的DTPL DEGs也是DTP DEGs(圖3E)，這進一步支持了它們的相似性。
接下來，探索了其他肺癌模型和患者DTPs中升高的基因。據報道，來自Hallmark基因集的脂肪酸代謝(FAM)和活性氧(ROS)特征在奧希替尼處理PC9細胞后產生的DTPs中更高; 兩種特征評分在簇6之外的BL細胞中低，而在DTPs細胞中最高(圖3F)。使用包含EGFR和其他驅動突變的腫瘤細胞隊列，使用各自的激酶抑制劑治療，肺泡signature和一組629個基因，與治療na?ve腫瘤(RD標記)相比，在殘留疾病中差異過表達。這些基因在BL細胞中表達量低，在DTPL細胞中表達量居中，在DTPs中表達量高(圖3F)。總的來說，DTPs和DTPL細胞在G1細胞周期階段相似地富集，共享多個基因和signature表達譜，據報道在其他DTPs或治療后殘留腫瘤中過表達，并通過軌跡和偽時間分析提示其發育相關。
通過scRNA-seq，在DTPs中富含的top DEG是ECM1，并被證實在一小部分BL腫瘤細胞中在蛋白質水平上表達(圖2E,F)。免疫組織化學方法檢測了ECM1在治療初期切除的具有EGFR突變的原發LUAD中的表達。所有病例中有71%有ECM1的表達，其中大多數有罕見或局灶性表達。
使用常見的“高置信度”DTP DEG，帶有Hallmark基因集的GSEA仍然將NF-кB確定為最高上調途徑，而E2F、細胞周期和MYC仍然是DTP中最高下調途徑(圖4A)。通過量化另一個由EGFR突變的肺癌細胞中的直接靶點組成的NF-кB信號的表達，證實了NF-кB的發現。這一特征在DTP細胞中最高，在DTPL細胞中居中，在BL細胞中最低(圖4C)。
接下來，對ENCODE和ChEA轉錄因子靶基因集進行了GSEA。在活性只有一個方向變化的因子中，GATA2是DTP和DTPL細胞中上調最多的轉錄因子(圖4D,E)。據報道，GATA2至少部分通過激活NF-кB來促進肺癌的生存。MYC是DTP和DTPL細胞中最高下調的轉錄因子，E2F在這兩個群體中也顯著下調(圖4D,E)。在DTP/DTPL細胞中，NFE2L2/NRF2活性被預測上調，從而促進了周期PC9 DTPs的產生和EGFR TKI耐藥性的產生。NRF2的結果得到了證實，即A549細胞中由直接NRF2靶標組成的signature在DTP中最高，在DTPL細胞中居中，在BL細胞中最低(圖4F)。
為了研究不同EGFR突變的肺癌PDX之間治療初期腫瘤細胞群體和DTP異質性的潛在相似性，在另一個TKI治療的PDX模型上進行了scRNA-seq分析。PHLC164具有EGFR外顯子19缺失和T790M突變，并與奧西美替尼治療50天以產生DTP(圖5A)。對BL和DTP細胞的scRNA-seq聯合分析表明，49%的DTP位于第3簇，包含少量BL細胞亞(圖5B)，代表DTPL細胞。PHLC164 DTPs和DTPL細胞中至少有24%和18%的DEG分別與PHLC137中相應的群體共享(圖5C)。PHLC164 DTP DEGs也富集了與PHLC137 DTP DEGs相似的上調和下調通路(圖5D)。最后，在患者樣本中鑒定的PHLC164 DTPs具有殘留疾病(RD)和肺泡特征的表達升高，并且可以確認PHLC164 DTPL細胞具有肺泡特征的中間表達(圖5E)。因此，用不同的TKIs治療的不同EGFR突變肺癌PDX模型在已有的DTPL細胞和DTPs中顯示出一些相似性。
DTP腫瘤間質獨特的癌相關成纖維細胞(CAF)表型。
CAFs是一種異質間質細胞，可促進癌癥的腫瘤進展，并與TKI治療后復發有關。TKI治療如何改變treatment-na?ve與DTP癌細胞中的CAF尚不清楚。使用scRNA-seq數據比較PHLC137模型中BL和DTP腫瘤中的CAFs(圖6A)。在兩種腫瘤狀態下，大約3900個小鼠細胞被標記為成纖維細胞(圖6B)。CAFs聚集成4個亞群(圖6C)，簇4和5在狀態之間的共享比例相似。簇2在BL中CAF亞群最多，但在DTP腫瘤中幾乎完全消失。相反，簇0在BL狀態下是次要亞群體，在DTP狀態下是優勢亞群體。
簇2為肌成纖維細胞“myCAFs”，是treatment-na?ve癌癥中描述最一致的CAF群體，由TGF-β信號通路誘導。簇4的特征描述了myCAF在傷口愈合和T細胞滲透中的活躍作用。簇5是iCAF，由于其分泌的細胞因子，具有更多的促炎表型。
通過偽時間分析(圖6E)，簇2、簇5和簇0 CAF在軌跡結束時被視為不同的位置，這表明它們代表明確的穩定狀態。簇2和簇5中的狀態可以與這些簇的top signature所描述的CAF相關。簇4可能是不同的中間激活狀態。
對分泌信號因子的分析顯示，每個CAF簇都表達促生長和免疫調節因子，簇4、簇5和簇0也分泌促血管生成信號，簇2產生TGF-β配體(圖6F)。雖然Fgf7在簇0 CAF中上調，但在DTP癌細胞中ERK活性并沒有增加。免疫調節因子是cluster特有的，突出了每一種CAF亞型可能發揮其獨特的免疫調節形式。
IL6-JAK-STAT3信號在0簇CAFs中活躍，DTP基質細胞中約40%的磷酸化-STAT3，比BL基質細胞增加了兩倍。同樣，DTP癌細胞中的STAT3磷酸化相對于BL癌細胞增加(圖7A,B)。IL6已被證明可以促進EGFR突變肺癌細胞系對TKI治療的生存。總之，這些研究結果表明，由簇0 CAFs分泌的Il6可以激活PHLC137 DTPs中的STAT3，促進其在體內的生存。
TKI治療期間，簇2和簇0 CAF之間的顯著轉變表明這些群體相互轉換。首先從PHLC137 BL和DTP腫瘤中提取CAF培養物。發現與這些CAF的體內轉錄圖譜一致。TGF-β刺激BL CAF進一步增加了簇2 CAF標記的表達(圖7B)，與簇2的表型類似于TGF-β調節的MyCAF。相反，用IL1α刺激BL CAF，誘導簇0標記的表達(圖7B)。這些發現與用人類CAF進行的類似實驗平行。然而，總體而言，數據支持由TGF-β和NF-кB激活劑調節的CAF可塑性和相互轉化機制。最后，測試了在EGFR突變的肺癌細胞和CAF的共培養中，厄洛替尼治療是否可以將簇2 CAF轉化為簇0表型。在厄洛替尼治療12天后，簇0表型更強大的標記之一IL6的表達增加了12倍，而簇2標記Lrrc15的表達下調(圖7C)。因此，TKI治療前和治療后的主要CAF群體可能反映了一種單一類型的CAF群體，其表型受TGF-β和NF-кB激活劑的調節，以及它們的調節受TKI的存在或缺失(圖7D)。
DTP腫瘤保持了未經治療的(BL)腫瘤的基因組克隆結構，但表現出減少的增殖。scRNA-seq鑒定了一種罕見的BL細胞亞群(DTP樣細胞，DTPL)，與DTP細胞在轉錄水平上相似，并且在DTP細胞中上調的通路具有中等活性。此外，腫瘤中TGF-β激活的腫瘤相關成纖維細胞(CAF)被富含IL6的CAF群體所取代。體外實驗表明，這些群體的相互轉換依賴于TGF-β和NF-кB信號的水平，后者受TKI的存在調節。DTP顯示有NF-кB和STAT3信號增強的跡象，這可能促進了它們的生存。
