腦膜瘤類器官與scRNA-seq結合發現腫瘤關鍵亞群及新的治療策略

今天小編給大家介紹一篇3月底剛剛發表在advanced science（IF：17.521）上的文章。作者從單細胞角度切入，發現了影響腦膜瘤發展的關鍵細胞亞群——SULT1E1⁺亞群。在高級別腦膜瘤中SULT1E1⁺亞群可能直接有助于免疫抑制環境的形成。作者開發了一種類器官模型MO，它保留了親代腫瘤的瘤內異質性，根據對MO模型的研究，作者提出了一種有效抑制SULT1E1⁺亞群的潛在治療策略。SRT1720可以作為全身治療或放射增敏劑來抑制腫瘤生長。接下來，小編就為大家詳細解讀一下文章內容吧。

背景

腦膜瘤是世界范圍內最常見的顱內原發腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的38.3%。≈80%的腦膜瘤起源于腦膜的蛛網膜帽細胞（蛛網膜中的一種上皮細胞），80%的腦膜瘤被歸類為良性(I級)，手術切除是這些患者唯一必要的治療方法。然而，對于高級別腦膜瘤(II級和III級)，復發率和死亡率仍然很高。II級和III級腦膜瘤的10年無進展生存率分別為22.6%和0%。因此，確定未來改善這類患者治療所需的有效分子靶點是至關重要的。

對NF2、AKT1、TRAF7、SMO和PIK3CA等基因的識別有助于深入了解腦膜瘤發生的分子機制。然而，對導致II級和III級腦膜瘤惡性的關鍵因素缺乏了解，阻礙了有效藥物的開發。盡管TERT啟動子突變和CDKN2A/B純合子缺失與腦膜瘤的高侵襲性和早期復發有關，但只有少數惡性腦膜瘤患者存在這些基因組變化。因此，闡明高級別腦膜瘤與良性腦膜瘤的區別是至關重要的。

腫瘤內的異質性在侵襲性惡性腫瘤的發生、演變和發展中起著重要作用。然而，腫瘤內異質性還沒有從細胞的角度進行說明。在這項研究中，作者對腦膜瘤樣本進行了scRNA-seq分析，并鑒定了腦膜瘤腫瘤細胞的獨特亞群。而這一亞群是控制高級別腦膜瘤侵襲性的關鍵因素。接下來，我們開發了一種新的患者來源的腦膜瘤器質性(MO)模型，在該模型中，我們能夠復制腦膜瘤的異質性。這一里程碑使我們能夠研究這一獨特的細胞亞群，目的是開發有效的治療方法。這些結果為高級別腦膜瘤的驅動因素和潛在的治療靶點提供了新的見解。

結果解讀

高級別腦膜瘤中巨噬細胞的M2樣極化

為探討I級和II/III級腦膜瘤的細胞群和分子特征的差異，從2例I級和1例II級腦膜瘤原發腫瘤標本中分離出25617個細胞。確定了8個細胞群，包括腫瘤浸潤性B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、NK細胞、T細胞和惡性細胞，并確定在每個細胞團中唯一表達的基因(圖1B-C)。II級腦膜瘤中的巨噬細胞數量和比例都高于I級腦膜瘤，并且M2表型相關基因MRC1和CD163在II級腦膜瘤中的表達明顯升高(圖1D-E)。此外，與I級相比，II級腦膜瘤樣本的M1評分顯著低于I級，而M2評分顯著高于I級(圖1F)。免疫熒光染色顯示，II/III級腦膜瘤中CD206+/CD68+細胞比率增加（CD206是M2巨噬細胞標志物；CD68是單核/巨噬細胞標志物）(圖1G)，證實巨噬細胞呈M2樣極化。綜上所述，這些結果證實了M2樣極化巨噬細胞是高級別腦膜瘤的主要成分，這與先前的研究結果一致。

高級別腦膜瘤中獨特的腦膜瘤細胞亞群

由于M2樣巨噬細胞極化與腫瘤的發生廣泛相關，作者接下來試圖確定腦膜瘤細胞亞群(MC)對M2樣極化的貢獻。總共確定了六個MC亞群(圖2A，B)。其中MC SULT1E1⁺亞群僅在II級腦膜瘤樣本中發現(圖2C)。偽時序分析結果顯示，在II級腦膜瘤中，許多腫瘤細胞位于軌跡的起點(圖2D)。MC SULT1E1+亞群主要分布在軌跡開始處，顯示出與其他亞群不同的分化狀態(圖2E)。在偽時間尺度上，MC SULT1E1⁺的特征基因在開始時高表達，然后逐漸下降(圖2G-H)。

MC SULT1E1⁺亞群的驗證與研究

MC SULT1E1⁺亞群中的許多marker基因在II/III級腦膜瘤樣本中高度表達(圖3A)。免疫組織化學染色顯示，在II/III級和復發性腦膜瘤(圖3B-C)中，MC SULT1E1+細胞數明顯高于I級和原發腦膜瘤。接下來，作者使用CellChat進行了細胞-細胞相互作用組分析，以更好地表征MC SULT1E1⁺亞群與其他細胞類型(尤其是巨噬細胞)相互作用。MC SULT1E1⁺亞群在細胞-細胞相互作用中非常活躍(圖3D)，在許多癌癥相關信號通路中與其他MC亞群表現出強烈的細胞-細胞通訊(圖3E)，這表明MC SULT1E1⁺通過調節其他腫瘤細胞而作為腫瘤行為的核心調節劑。MC SULT1E1⁺在CSF信號通路中發揮源細胞作用，調節巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞的功能(圖3F)。作為關鍵的下游效應細胞，巨噬細胞和單核細胞也表現出表皮生長因子(EGF)來源細胞的特性，并且抵抗信號傳導，與腦膜瘤或免疫細胞相互作用。MC SULT1E1⁺與巨噬細胞和單核細胞之間的強相互作用提示這個獨特的亞群可能參與了m2樣極化和腫瘤的發展。

腦膜瘤類化合物保留了親代腫瘤的瘤內異質性

作者開發了一種新的患者來源的腦膜瘤類器官 (MO)模型來進一步表征MC SULT1E1⁺亞群。將腫瘤切成小塊，平均直徑1~2 mm。在定制化培養條件下，腫瘤塊一般在1周內形成圓形MO(圖4A)。由于這一策略避免了腫瘤的機械和酶解離，大多數細胞類型和細胞間的相互作用都得到了很好的保存。此外，腫瘤標本保存時間短，質量好，有利于MOs的產生。作者從21個腫瘤樣本中開發了16個MO。

每個MO和相應的腫瘤標本在組織學特征上相似(圖4B)。并保留了與母細胞腦膜瘤不同亞型(腦膜上皮型、纖維型、血管瘤型、微囊型和非典型型)相同的組織病理學特征。為了進一步確定細胞特性和腫瘤微環境，對幾種細胞marker進行了免疫染色分析。MOs中有腦膜瘤細胞(SSTR2a+)和血管系統(CD31+，也有母系腫瘤中的免疫細胞，如巨噬細胞(CD68+)和T細胞(CD3+)(圖4D)。對四種MOS及其相應的親代腫瘤進行了全外顯子組測序。結果表明，MOs保持了親本腫瘤基因組的改變，包括NF2、SMO和SMARCB1的突變(圖4E)。值得注意的是，在NF2突變和野生型腫瘤樣本中成功地建立了MO模型，表明該方案適用于具有不同遺傳背景的腦膜瘤。

該方案的一個主要優點是它避免了常規2D原代細胞培養的潛在克隆選擇。免疫組織化學染色證實，II級MOs保留了相應親代腫瘤的MC SULT1E1⁺亞群(圖4F)。此外，用SULT1E1抑制劑三氯生處理后，SULT1E1⁺MOs中EDU⁺細胞的數量顯著減少，但并未顯著降低SULT1E1的表達水平(圖4G)。由于細胞的異質性，某些MO可能富含SULT1E1⁺亞群細胞。同時，部分MOs不含SULT1E1⁺亞群細胞。

SULT1E1+MOs原位移植后表現出腦侵襲能力

為了進一步探討MO在體內的生物學行為，作者進行了SULT1⁺和SULT1E1^?MOs的硬膜外移植。將MOs移植到免疫缺陷小鼠的頭骨和腦膜之間的間隙中，而不破壞腦膜或腦組織(圖5A)。移植后2個月進行核磁共振掃描。結果顯示，移植SULT1E1^?MOs小鼠的MOs與腦之間輪廓清晰，但移植SULT1E1⁺MOs小鼠的腦組織形態異常(圖5B)。移植SULT1E1⁺MOs的異種移植物在蛛網膜下腔可見H&E染色，并顯示異常的腦-類器官邊界(圖5C)。用抗CD44抗體的免疫組織化學方法證實了SULT1E1⁺MOs對腦的侵襲(圖5D)。腦膜瘤細胞包圍的大腦皮層和殘留皮質組織破壞，進一步證實SULT1E1⁺MOs的腦侵襲。免疫組織化學染色還顯示MC SULT1E1⁺亞群在所有腦侵襲性MOs中均有保留(圖5E-F)。因此，移植后含有MC SULT1E1⁺亞群的MOs具有腦侵襲能力，這是一種與高級別腦膜瘤相同的獨特生物學行為。

用MO模型高通量篩選MC SULT1E1⁺亞群中的治療靶點

接著作者通過抑制MC SULT1E1⁺亞群來研究潛在的治療策略。為此，一組305種表觀遺傳化合物在SULT1E1⁺高級別腦膜瘤樣本的四個原代MC系上以10μm的濃度進行了測試。陽性命中定義為DMSO對照組的細胞存活率<10%(圖6A)。按總命中率排名前三位的化合物是SRT1720、PS341和UNC0631(圖6B)。SRT1720是SIRT1的特異性合成激活劑，PS341(bortezomib)是針對26S蛋白酶體的選擇性蛋白酶體抑制物，UC0631是組蛋白甲基轉移酶G9a的有效抑制物。

作者在三個MO來源的腦膜瘤原代細胞系中進一步證實了抑制作用(圖6C)。用這三種化合物處理大小相似的SULT1E1⁺MOs，其對原代腦膜瘤細胞系(PMC)顯著抑制。而且來自同一患者的MOs的反應也是不同的，這表明MOs代表了原始腦膜瘤的化療耐藥和異質性。SRT1720對SULT1E1⁺MOs的抑制作用與對2D細胞的抑制作用相似(圖6D)。免疫組織化學染色證實，SRT1720治療后SULT1E1⁺MOs中SULT1E1的表達顯著下調(圖6E)。此外，2.5μm的SRT1720與放射聯合治療可顯著抑制SULT1E1⁺MOs的細胞增殖(圖6F)。這些數據表明，SRT1720能夠有效地抑制高級別腦膜瘤的MC SULT1E1⁺亞群，因此具有潛在的治療和輻射增敏價值。

總結

這篇文章中，作者首先從單細胞的角度切入，驗證了M2巨噬細胞促進腦膜瘤的發展和侵襲性，這也表明高級別腦膜瘤中存在免疫抑制微環境。在單細胞研究過程中作者發現了高級別腦膜瘤中存在的一個細胞亞群MC SULT1E1⁺，并發現MC SULT1E1⁺亞群通過調節其他腫瘤細胞和免疫細胞的功能來推動惡性腫瘤的發生。由于SULT1E1⁺亞群與巨噬細胞間通過CSF1-CSF1R信號有很強的相互作用，因此高級別腦膜瘤中SULT1E1⁺亞群可能直接有助于免疫抑制環境的形成。

接下來，作者開發了一種類器官模型（MO），它的優勢是避免了將腫瘤樣本消化成單個細胞的過程，從而確保了MO模型中大多數細胞類型的保存。MOs具有復雜的細胞組成，包括腫瘤細胞、血管內皮細胞、腫瘤浸潤性巨噬細胞和T淋巴細胞，所有這些都與親本腫瘤相似。MOs可能成為研究腦膜瘤腫瘤微環境的有力工具。最重要的是，MOs保留了相應親代腫瘤的SULT1E1⁺亞群。

作者提出了一種有效抑制SULT1E1⁺亞群的潛在治療策略。SRT1720可以作為全身治療或放射增敏劑來抑制腫瘤生長。SRT1720通過SIRT1/HIF軸抑制器官和小鼠模型中的膀胱癌生長。