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大家好呀，今天分享的文章題為單細胞數據分析穩定和易損的動脈粥樣硬化斑塊之間不同的免疫環境，文章思路清晰，于今年一月發表在《Front Immunol》（IF = 8.786）上，讓我們來一起學習一下吧！
一、摘要
無論狹窄的程度如何，易損斑塊都是缺血性卒中和血栓性并發癥的重要原因。斑塊內免疫微環境的變化似乎是影響斑塊特征的一個重要因素。然而，穩定斑和易損斑之間的免疫微環境差異尚不清楚。在本研究中，對5例創傷患者的顳淺動脈和3例動脈粥樣硬化患者的斑塊進行了RNA測序，以初步確定斑塊中的關鍵免疫反應過程。采用流式細胞術（CyTOF）技術來探索9個易損斑塊和12個穩定斑塊之間的免疫組成的差異。
二、結果
1、分析斑塊和正常顳淺動脈的RNA-seq數據，初步探索斑塊內的免疫微環境
本文通過對3例動脈粥樣硬化患者斑塊和5例顱腦外傷手術患者顳淺動脈進行差異分析，得到16036個差異基因，其中，動脈粥樣硬化斑塊中有3656個基因表達上調。對上調的基因進行GO和KEGG注釋，主要富集在T淋巴細胞和B淋巴細胞的免疫反應以及與TNF信號通路相關的生物學過程中，這表明TNF-a在斑塊內介導免疫反應。隨后，作者通過xcell推斷RNA-seq數據的細胞類型和比例，結果顯示，顳淺動脈包含大量內皮細胞、平滑肌細胞和纖維細胞；動脈粥樣硬化斑塊除了這些細胞外，還包含大量的巨噬細胞、樹突狀細胞、T和B淋巴細胞。免疫浸潤分析的結果為后續選擇CyTOF抗體譜提供了指導。（圖1）
2、動脈粥樣硬化斑塊中免疫細胞的組成
根據影像學結果，作者將標本分為12個穩定斑塊和9個易損斑塊。在RNA-seq分析的基礎上篩選出特異性金屬抗體。使用無監督聚類方法Flowsom分析了21例患者動脈粥樣硬化斑塊的細胞組成（圖2），發現了15個簇，且巨噬細胞和淋巴細胞是斑塊的主要組成部分。巨噬細胞由6個細胞簇組成，占63.9%。淋巴細胞由T淋巴細胞和B淋巴細胞組成。而T淋巴細胞有7個簇，占31.9%。B淋巴細胞由兩個簇組成，占4.2%。T-SNE用于轉換高維CyTOF數據，并用于繪制所有樣本的免疫分區。（圖3）
3、T細胞在穩定斑塊中占優勢，巨噬細胞在易損斑塊中占優勢
比較這兩種斑塊的組成，每個細胞亞群都分布在兩種類型的斑塊中。T細胞以穩定斑塊為主，占57.2%。巨噬細胞占39.1%。而巨噬細胞是易損斑塊中最豐富的細胞群占56.4%。T細胞僅占36.7%。這表明了這兩個斑塊之間的免疫環境的差異。（圖4C）
4、CD4+T記憶細胞在穩定斑塊中更豐富，而CD11c+CD4c+T細胞在易損斑塊中分泌更高的IFN-r
斑塊中的T細胞類型是多種多樣的，有5個CD4+T淋巴細胞簇，包括記憶細胞和效應細胞。比較兩個斑塊中細胞亞群的比例差異，第10簇的CD4+T細胞是穩定斑塊中唯一更豐富的細胞組。CD45RO+和CD127是記憶細胞的表面標記物，共存于該簇的細胞表面。兩種斑塊的其他亞群含量無差異。然而，易損斑塊中的簇2（CD11c+CD4+T細胞）比穩定斑塊中分泌更高水平的IFN-r。（圖4B-I）
5、易損斑塊中的CD19+CD20-B細胞分泌更多的TNF-a和IL-6，而CD19-CD20+B細胞表達更多的PD-1分子
樣本中存在兩種類型的B細胞，這些B細胞表面有不同的分子模式。簇9表達CD19+，而簇8表達CD20，但不表達CD19。簇9還表達了參與細胞活化和遷移的表面標記物HLA_DR和CCR7，這表明該簇可能是一組活化的B亞群細胞。功能分析顯示，簇8在易損斑塊中表達了更高水平的PD-1分子。簇9顯示出較高水平的TNF-a和IL-6（圖4E-3和4E-4）。
6、易損斑塊含有更多的CD86+CD68+ M1促炎巨噬細胞
巨噬細胞是斑塊中最豐富的簇，包含多個細胞亞群（圖4C）。然而，與穩定的斑塊相比，第14簇是唯一一個在易損斑塊中更豐富的簇（圖4B-D）。這些簇表達CD68和HLA_DR。此外，與M1樣巨噬細胞對應的CD86存在于簇14的表面。多色免疫熒光檢測顯示，在易損斑塊中有更多的M1巨噬細胞（圖5A，B）。功能分析顯示，該簇也表達了IL-6和IFN-r（促炎細胞因子），功能分析未顯示出顯著性差異（圖4E-4）。
三、小結
本文對5例創傷患者的顳淺動脈和3例動脈粥樣硬化患者的斑塊進行了RNA測序，分析兩種斑塊的差異基因、使用上調基因分析兩種斑塊在功能層面的不同、使用xcell比較了兩種斑塊中免疫細胞比例的差異。并通過單細胞數據分析每類細胞浸潤的比例，在易損斑塊中發現了更多的CD86+CD68+ M1促炎巨噬細胞，而CD4+T記憶細胞主要出現在穩定斑塊中。此外，在易損斑塊中發現了一個IFN-r分泌的CD4+T細胞的CD11c+亞群。在B細胞的兩個亞群中，易損斑塊中的CD19+CD20-B細胞分泌更多的TNF-a和IL-6，而CD19-CD20+B細胞表達更多的PD-1分子。本文邏輯清晰，作者對兩種斑塊做了清晰地對比。
參考文獻：Ge P, Li H, Ya X, Xu Y, Ma L, He Q, Wang R, Liu Z, Zhang Q, Zhang Y, Wang W, Zhang D, Zhao J. Single-cell atlas reveals different immune environments between stable and vulnerable atherosclerotic plaques. Front Immunol. 2023 Jan 18;13:1085468. doi: 10.3389/fimmu.2022.1085468 . PMID: 36741406; PMCID: PMC9889979.
